автореферат и диссертация по педагогике 13.00.03 для написания научной статьи или работы на тему: Изменение энергетического обмена в скелетных мышцах при удлинении конечностей

Автореферат диссертации по теме "Изменение энергетического обмена в скелетных мышцах при удлинении конечностей"

г 5 ОД

На правах рукописи

ТРИФОНОВА Елена Борисовна

ИЗМЕНЕНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ ПРИ УДЛИНЕНИИ КОНЕЧНОСТЕЙ

(экспериментальное исследование)

13.00.03 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск - 1998

Диссертация выполнена в Уральском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии МЗ России, г. Екатеринбург Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор, академик МАНЭБ A.B. Осипенко Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, член-корреспондент РАМН

Захаров Ю.М. доктор биологических наук Дятлов Д.А!

Ведущая организация - Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г. А. Илизарова, г. Курган

Защита состоится « -¿-1 » _199g г на

заседании диссертационного совета К. 113. 13. 04 в Челябинском государственном педагогическом университете по адресу:

454 080, Челябинск, пр. Ленина, 69, ауд. о ¿V .

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки Челябинского государственного педагогического университета.

Автореферат разослан «

» _199g р

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Шибкова Д.З.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Изучение механизмов регенерации органов и тканей является актуальной проблемой современной биологии и медицины. Благодаря приме-пению в клинике и эксперименте метода удлинения конечности в настоящее время формируется концепция дистракционного гистогенеза ( Г.А. Илизаров, 1989; A.B. Осипенко, 1995; A.B. Осипенко, В.А. Чсрешнсв, 1997).

Накоплен большой фактический материал о различных механизмах регенерации тканей, в частности, костной и мышечной при дистракцион-ном остеосинтезе ( В.П. Штин, 1978; Г.А. Илизаров, 1984; В.И. Стецула и соавт., 1984; Л.Н. Кочутина, 1992).

О существенной роли биоэнергетики как в онтогенезе скелетной мышечной ткани, так и при ряде состояний, связанных либо с повышенной физической нагрузкой, либо с патологией, свидетельствуют многочисленные публикации (Е.В. Озолина, 1989; З.А. Поддубная, 1992; Л.А. Марчик, 1995; В.Н. Чеснокова, 1995; G.G. Corbucci, 1995; G. Japichino et al., 1995; K.E. Liaw et al., 1995; O. Pastoris et al., 1995; J.L. Rivero, 1995). Такое внимание является отражением актуальности проблемы энергообеспечения различных процессов, как одной из важнейших областей медицины. Что касается процесса репаративного гистогенеза, то наиболее широко освещенным можно назвать биоэнергетику посттравматического и дистракционного регенерата, где показан вклад как анаэробного, так и аэробного окислительного метаболизма (В.П. Торбенко, В.А. Семенов, 1974; В.Н. Матвеенко и соавт., 1981; Ю.Н. Бахлыков и соавт., 1985; A.B. Осипенко, 1986; Б.Я. Власов, 1987).

В отношении скелетной мышцы показана только стимуляция гликолиза при ее растяжении ( Л.С. Кузнецова, Г.А. Шульгина, 1982; JI.C. Кузнецова и соавт., 1985; 1993). Ресинтез макроэргов в удлиняемой мышце только за счет анаэробного окисления кажется маловероятным, поскольку примеров активного участия тканевого дыхания в регенерации тканей достаточно ( C.B. Цвиренко, Л.И. Савельев, 1984; Б.Я. Власов, Э.Б. Макарова, 1993; З.А. Шидов, О.В. Пшикова, 1995). Кроме того, в отношении скелетной мышцы отдельным аспектом рассматривается и функционирование креатинфосфотрансферазного механизма, составляющего основу энерго-дающих реакций в мышце в отличие от других высокодифференцирован-ных тканей ( С.Н. Лызлова, В.Е. Стефанов, 1994; S. Shoji, 1995; V.A. Saks, R. Ventura-Clapier, 1996).

Эти данные подтверждают предположение о структурно-метаболическом механизме рспаративной регенерации скелетной мышцы, энергообеспечение которого до настоящего времени полностью не раскрыто.

Цель работы: Исследование энергетического метаболизма растягиваемой мышцы в различных режимах дистракционного остеосинтеза и выбор оптимального из них.

Задачи исследования.

1. Исследовать активность и локализацию ряда энзимов окислительного метаболизма в удлиняемой мышечной ткани.

2. Исследовать тканевое дыхание скелетной мышцы при дистракци-онном остеосинтезе.

3. Определить динамику креатинфосфокиназной активности в удлиняемой скелетной мышце.

Л

4. Оценить функциональное состояние мышцы при дистракционном остеосинтезе.

5. Исследовать динамику активности некоторых окислительных энзимов сыворотки крови.

Научная новизна. Впервые представлена комплексная характеристика аэробного и анаэробного путей метаболизма, тканевого дыхания и их соотношения в динамике регенерации скелетной мышечной ткани в различных условиях удлинения конечности. Последнее позволило провести анализ воздействия разных темпов и методов удлинения конечности на адаптивные возможности окислительного метаболизма мышечных волокон при удлинении голени до 40-50% исходной величины.

В работе установлена четкая зависимость между режимом удлинения и изучаемыми показателями. Показаны преимущества билокапьного дистракционного остеосинтеза с темпом удлинения 1 мм.

Представлены новые данные о существенной роли кислорода и энергообеспечении репаративного миогенеза.

Проведение корреляционного анализа изучаемых показателей метаболизма в удлиняемой мышце и в сыворотке крови позволило использовать последние в качестве критерия процесса регенерации в мышце.

Практическая ценность работы. Представленные в работе данные могут быть использованы для индивидуального подбора режима удлинения, что особенно актуально при удлинении конечности более 30 % исходной величины. В случае применения режима монолокапьного дистракционного остеосинтеза, можно установить порог перерастяжения скелетной мышечной ткани, используя сывороточные маркеры.

Полученные данные используются при чтении курса лекций по регенерации тканей на кафедре патологической физиологии УрГМА.

Апробация работы. Основные положения проведенного исследования были представлены и обсуждены на съезде молодых ученых-травматологов (Тбилиси, 1989), на международной конференции, посвященной 75-летию академика Г.А. Илизарова и 25-летию РНЦ ВТО (Курган, 1996), на итоговых сессиях УНИИТО (1989; 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных данных, общего заключения, выводов, библиографического указателя, который включает 309 литературных источников, проиллюстрирована 57 рисунками и 23 таблицами.

*

На защиту выносятся.

1. Наличие связи между активностью гликолиза, аэробного окисления, креатинфосфотрансферазного механизма регенерирующей скелетной мышцы и величиной, темпом и методом удлинения конечности.

2. Существенная роль кислородзависимых реакций в энергообеспечении мышечной ткани при удлинении.

3.Оптимальные условия для регенерации скелетной мышцы создаются при билокальном дистракционном остеосинтезе с темпом удлинения 1 мм в сутки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Эксперименты выполнены на 104 взрослых беспородных собаках в трех сериях.

В первой серии (31 животное) удлинение голени проводили методом монолокального дистракционного остеосинтеза после компактотомии большеберцовой кости на уровне средней трети ее диафиза при сохранении внутри костного кровоснабжения (МДО). Темп удлинения составлял 1 мм в сутки. Сроки наблюдения: 10, 50, 90 суток дистракции; 60, 120 и 180 суток фиксации.

Во второй серии (30 животных) удлинение голени осуществляли методом билокального дистракционного остеосинтеза после компактотомии большеберцовой кости на уровнях верхней и нижней трети (БДО, 2 мм в сутки). Днстракцию с темпом 1 мм в сутки на каждом уровне начинали на седьмые день после операции. Сроки наблюдения составили: 5, 25, 45 суток дистракции; 60, 120, и 180 суток фиксации.

В третьей серии (32 животных) голень удлиняли также как и во второй серии методом билокального дистракционного остеосинтеза с суточным темпом 2 мм на каждом уровне (БДО, 4 мм в сутки). Сроки наблюдения составили: 3, 12, 23 дня дистракции; 60, 120, 180 суток фиксации.

Контролем служили интактные животные (7собак), содержащиеся в аналогичных условиях, и животные (4собаки), у которых проводили ком-пактотомию без дистракции.

Рентгенологическое исследование выполняли на опытной голени собак в двух стандартных проекциях - передне-задней и боковой сразу после оперативного вмешательства и в динамике соответственно срокам наблюдения.

Исследования сыворотки крови проводили в соответствии с опытными сроками, а взятие фрагмента малоберцовой мышцы - при выведении из опыта.

Все процедуры по выделению клеточных и субклеточных фракций проводили в режиме 0/+4° С. Среды выделения: 0,25 М раствор сахарозы, содержащий 10 мМ триэтаноламин и 2 мМ ЭДТА (рН 7,4); 0,145 М раствор КС1, содержащий 3,3 мМ КНС03 (рН 7,4); конечное разведение гомо-гената 1 :9.

Для удаления неполностью разрушенных клеток и ядер гомогенат мышцы центрифугировали 10 мин при ЮООй (1 - 0/=2°С). Надосадочную жидкость сливали, а рыхлый осадок отбрасывали. Для выделения митохондрий надосадочную жидкость центрифугировали на рефрижераторной центрифуге 15 мин при 14000§. После центрифугирования надосадочную жидкость использовали для определения активности цитоплазматических форм энзимов. Осадок митохондрий гомогенизировали, отмывали, для разрушения использовали детергент Тритон Х-100. Общую активность энзимов определяли с использованием следующих буферов: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,8 для определения активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ); Ыа - глициновый буфер 85 мМ, рН 10,0 для малатдегидрогеназы (МДГ); 0,05 М К - фосфатный буфер, рН 7,5 для лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Активность ЛДГ и МДГ мышечной ткани определяли по скорости окисления НАДН, которая регистрировалась спектрофотометрически по убыли оптической плотности при длине волны 340 нм ( Ещенко Н.Д., 1982; Беуе! М., Тоуагек X, 1959; Но1югее НЛ., 1970).

Инкубационная среда для определения общей активности креатин-фосфотрансферазы (КФК) состояла из 50 мМ трис НС1, рН 7,2; 1,0 мМ АДФ, 30 мМ Мц(СН3СОО)2; 2 мМ глюкозы; 0,25 мМ НАДФ; 0,5 ед/мл гек-

сокимазы; 0,5 сд/мл глюкозофосфатдсгидрогеназы; 0,5 ед/мл креатинфос-фотрансферазы. Реакцию начинали добавлением крезтинфосфата, измеряя нарастание оптической плотности НАДФН при 340 нм через 30 сек в течение 3-4 мин (Северин С.Е., 1989).

Разделение изофермеитов ЛДГ осуществляли методом «дискэлек-трофореза» в полиакриламидном геле с использованием оборудования для вертикального электрофореза фирмы REANAL (Маурер, 1971). На поверхность геля наносили гомогенат мышцы из расчета 200 мкг белка на трубку.

Количество лактата и пирувата в мышце определяли по методам, описанным Ещенко Н.Д. (1982), в основе которых лежит оптический тест Варбурга.

Активность Са2+- зависимой АТФ-азы определяли по приросту неорганического фосфора в период инкубации при 37° С (Северин С.Е., 1989). Инкубация проходила в среде следующего состава: 100 мМ KCl; 3 мМ АТФ; 5 мМ MgCL2; 0,5 мМ CaCL2: 0,5 мМ ЭДТА; 30 мМ строфантин К. Неорганический фосфор определяли, используя наборы фирмы Lachema.

Кислородзависимые реакции (тканевое дыхание, оксигенацию и локальный кровоток) исследовали различными приемами полярографии. Тканевое дыхание определяли с помощью закрытого платинового электрода Кларка в растворе Хенкса при 37° С. При этом анализировали скорость дыхания на эндогенных субстратах и скорости дыхания в присутствии экзогенного сукцината натрия, динитрофенола, амитала и малоната натрия. Показатель скорости дыхания выражали в наноатомах кислорода, поглощенного за 1 мин 1 мг белка или 1 млн клеток. Оксигенацию тканей дист-ракцпонного регенерата определяли по напряжению кислорода ( Р02) и при проведении кислородной пробы ( Березовский В.А., 1975; Коваленко

Е.А. и соавт., 1975). Скорость локального кровотока оценивали методом водородного клиренса.

В сыворотке крови собак определяли общую активность ЛДГ, КФК, используя наборы реактивов фирмы ЬасИста.

Количество молочной кислоты определяли по методу Асташенковой К.Ю. (1973), количество пировиноградной кислоты по методу Бабаскина (1976).

Белок определяли в мышечном гомогенате и суспензии митохондрий по Лоури (Ьоуугу е[ а!., 1969); в сыворотке крови - биуретовым методом.

Глюкозу в мышце определяли с использованием энзиматического метода совместно с о-толуидиновым (Прохорова М.И., 1982).

Гистохимическое выявление ЛДГ и СДГ проводили на поперечных срезах мышечных волокон, приготовленных на микротом-криостате, толщиной 8-10 микрон. Для выявления дегидрогеназ использовали тетразо-лиевый метод (Пирс Э., 1962; Лойда З.И. и соавт., 1982).

Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета программ 81а1дгар11 3,0; модулей «Статистика» и «Статграфика».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности анаэробного обмена регенерирующей скелетной мышечной ткани.

Проведенное исследование показало стимуляцию биоэнергетических реакций (гликолиза, цикла Кребса, тканевого дыхания и КФК-реакции) иа отдельных этапах эксперимента.

Исследования анаэробного метаболизма удлиняемой скелетной мышечной ткани выявили его стимуляцию, зависящую от темпа, величины и метода удлинения. Реакция энзиматических систем в сторону активации оказалась сходной при длительном воздействии фактора натяжения (первая серия - 90 суток дистракции) и большом темпе удлинения (третья серия - 2 мм в сутки на каждом уровне). Рост общей активности ЛДГ, параллельно с увеличением доли М-субъединиц и соответственным накоплением молочной и пировиноградной кислот, характерен с начальных этапов эксперимента у всех животных, достигает своего максимума, в основном, к концу удлинения (400%, 292%, 303%, р<0,05; первая - третья серии соотв.). Далее эта закономерность менялась на противоположную. По степени выраженности группы животных можно расположить первая - третья - вторая.

Во второй серии мы наблюдали наименьший рост как общей активности ЛДГ, так и ее анаэробных тетрамеров, что способствовало увеличению не только лакгата, но и пирувата. Последний, как известно, может активно включаться в глюконеогенез, что немаловажно при дистракционном миогенезе.

Сопоставление полученных результатов с морфологическими выявило взаимосвязь между состоянием кровоснабжения регенерирующей скелетной мышцы, степенью развития соединительной ткани, некрозом части мионов и степенью активности гликолиза.

Гистохимические исследования подтвердили полученные результаты. Увеличение количества гранул формазана при окраске на ЛДГ, появление крупнодисперсных зерен, их агрегация указывают на активацию фер-1 мента. На 23-и сутки удлинения в третьей серии прослеживались не только крупные зерна, но и скопление их преимущественно в центральной области волокна, что указывает на компартмсптализацию анаэробного метаболизма

именно в этих участках. По интенсивности окраски на ЛДГ первая и третья серии близки. Более равномерное распределение гранул формазана отмечено во второй серии собак. При завершении эксперимента в первой серии животных равномерного распределения зерен не достигнуто, в некротизи-рованных мионах выявлены единичные гранулы.

Данные экспериментов свидетельствуют о целесообразном использовании монолокального дистракционного остеосинтеза до 27-30% исходной величины, т.к. в этих пределах удлинение мышцы сопровождается умеренной активацией анаэробного окислительного метаболизма. При дальнейшем удлинении мы наблюдали и резкий рост активности ЛДГ к 90 суткам дистракции и последующий значительный ее спад, даже угнетение при завершении эксперимента, что дало основания связывать это с нарушением кровоснабжения ткани.

Динамика исследованных показателей гликолиза в сыворотке крови и в регенерирующей скелетной мышечной ткани аналогична. Фазовый характер изменений (рост на этапе удлинения и нормализация после его завершения) прослеживались во всех группах собак (ЛДГ - 228%; 130%; 228%; р<0,05; первая - третья серии соотв., при достижении 25% удлинения). Эти данные являются показателем анаэробизации метаболизма не только в мышце, но и в костном регенерате. Однако, ИФ спектр ЛДГ близок к ИФ спектру мышцы, т.к. в костном регенерате велика доля Н-субъединиц.

В отличие от проведенных ранее исследований, мы сравнили условиях растяжения: МДО и БДО, и величину растяжения скелетной мышцы до 50 % (Кузнецова Л.С., Шульгина Г.А., 1982; Кузнецова Л.С. и соавт., 1985; 1993; Попков В.А. и соавт., 1991). Таким образом, принимая во внимание наибольший рост общей активности ЛДГ в первой серии собак и с

Динамика пока (ате.тей i.uiKii.iiua скелетной мышечной ткани и услошшх öii.-io-калыпя о дистракинонного остеоснптоа с темпом удлинении 1мм в сутки на каждом уровне

11селедуе-мые показатели Исходный уровень Дистракиня (сутки) Фиксация (сутки)

5 ШШШ 45 120 180

Обшая активность ЛДГ. нмоль НАДН/мпн ч мг белка 307.0 ± 20,0 п = 7 12(.,5 ± 21.7 11- .3 -13-1.0 ± п.Г п — 6 S95.3 ± 23.2' п = 7 435,7 ± 4,б' п = 4 396,2 ± 5 S7' п = 4 376,6 ± 65,9 п = 5

Соотношение Н/М с\лм.елтищ ЛДГ 0.6.3 ± 0,03 11 7 0.5м г 0.03' п > 0.52 i 0.07 и г> 0.41 ± 0.01* ч = 7 0.57 ± 0,0 Г 11 = 4 0.56 ± 0,04 11 = 4 0,60 ± 0.09 и - 5

Уровень МК мкмоль МК/ 1 1 К.1111! 0.0S i 0.05 11 -7 о.".: t 1 13 »- 3 3.52 г 0.14' и - (1 4,30 ± 0.41' п = 7 3.8S ± 0,02' 11 = 4 1.30 ± 0.53 п =4 0,95 i 0.07 п= 5

Уровень 1 IHK.- мкмольПВК /г ткани 0.128 i 0.00') 11 = 7 0.1)1 ± (..015 п - 3 0.692 .'0.013* п =- 6 0,507 + 0.06S' п - 7 0,456 ±0,036' п = 4 0,450 iO.OSl' 11 = 4 0,383 ±0,0X3 п = 5

Соотношение МК'ЛВК 7,672 п = 7 9. 109 11 = 3 5.0S7 и = 6 S. 4SI п = 7 8. 509 п = 4 2.S32 п = 4 2.4S8 п = 5

*- р < 0,05 по сравнению с исходным уровнем

Динамика покачятелен аэробного метаболизма удлиняемой мышцы в условиях билокпльного дигтрактшонмого остеосинтем с суточным темпом дигтрпкинп I.m.m

па каждом уровне

Исследуемые показатели Исходный уровень Дистракиня (сутки) Фиксация (сутки)

5 25 -15 löoiliil ЙШ1Ш 180

Обшая актив- 281.3 161.5 258,6 10S7.1 350.2 35S.3 240.1

нос Ii, МД1', J 23 ! 6 1.6 + 8.9 ±67,0 ±17.5' ±53.3 ±66.3

нмольНДДН' 11 = 7 п - 3 п = 6 ч=7 Ii = 4 п = 4 и = о

mihi \ мг оелка

Соотношение 2.46 2.50 1.26 1.48 1,48 1.67 2.60

МФ МДГ ±0,07 ±0.03 ±0,09' ±0,07' ±0,0.3' ±0,20' ±0.13

11 = 7 н = 3 п = 6 п = 7 Ii = 4 п = 4 11 = о

Общая актив- 2.21 1.13 3,32 6,44 - - -

ность СДГ.мкг ±0.87 ±0.22 ±0.41* + 1,44'

Ff(CN,.)/Mim х п = 7 п = 3 11 = 6 п = 7

мг белка

* п. о п4; I

учетом данных морфологических исследований, можно рекомендовать использовать МДО только до 27-30 % удлинения конечности.

Следует подчеркнуть многофакгорную роль пирувата в скелетной мышце: утилизация его через цикл лимонной кислоты непосредственно в мышцах; использование в глюконеогенезе и синтезе АМК. Таким образом, гликолиз в данном случае является источником АТФ для сократительной функции и восстановительных синтезов, поставщиком субстратов пластического обмена.

Динамика аэробного метаболизма н креатинкнназнон реакции

Описанное в литературе преимущественное повреждение «красных» волокон в начале воздействия экстремальных факторов, встречается и при удлинении голени. Именно этот механизм, возможно, приводит к снижению активности МДГ и СДГ в начале растяжения мышцы на фоне активации анаэробного гликолиза. Начиная с середины дистракции наблюдали рост активности этих энзимов с максимумом в конце удлинения (рост МДГ - 281%; 386%; 311%; р< 0,05; первая - третья серии соотв.). Такая динамика свойственна как для НАД-зависимого окисления (МДГ), так и для ФАД-зависимого окисления (СДГ). Выраженность обнаруженных изменений, как и при гликолизе, зависит от темпа, срока и метода удлинения. Сочетание этих условий позволило выделить оптимальные: билокапьный дист-ракционный остеосинтез с суточным темпом удлинения 1 мм на каждом уровне. В целом, степень активации аэробного окислительного метаболизма в зависимости от групп животных располагается следующим образом: вторая - третья - первая.

При удлинении мышц обнаружили также и активацию малатного челночного механизма, главным образом, за счет его цитоплазматической фракции, т /

Нам удалось вновь проследить корреляцию между активностью СДГ и изменениями гистоструктуры мышечного волокна, в частности, уменьшением его диаметра, склерозированием, распространением очагов миоцитолизиса, встречающиеся в основном в первой и третьей сериях эксперимента. Локализация зерен формазана при окраске на СДГ в субсарко-леммальной области соответствовала скоплениям митохондрий. Увеличение активности СДГ на поперечных срезах волокон может быть результатом набухших митохондрий, которые обладают высокой скоростью окис, ления янтарной кислоты. Появление «волокон-мишеней», нарушение дисперсности гранул, встречающиеся при большом темпе ( 2 мм в сутки на каждом уровне, третья серия) и при длительном воздействии фактора натяжения ( 90 суток дистракции, первая серия), по-видимому, являются негативными признаками, свидетельствующими о нарушении механизмов адаптации. Не обнаружено восстановление гистохимической картины СДГ-активности в третьей серии собак при завершении эксперимента, т.к. сохранилось неравномерное распределение гранул, в разных участках мышечных волокон присутствуют очаги без ферментативной активности, встречаются гранулы с разной дисперсностью. В отличие от других, во второй серии в срок 180 суток фиксации в аппарате метаболическая перестройка не завершена, сохраняется незначительная гиперферментемия.

Динамика МДГ сыворотки крови не коррелирует с таковой в удлиняемой мышце. В частности, в сыворотке крови отсутствуют четкие пики активности МДГ.

Исследование метаболической адаптации при дистракционном мио-генезе было бы неполным без анализа состояния КФК - реакции. В большинстве случаев, связанных либо с чрезмерной нагрузкой, либо при росте волокон в постнатальном периоде обнаружена высокая активность КФК (Макс В.Л. и соавт., 1980; Чарыева A.A., 1986; Ленкова Р.И. и соавт., 1988,

Тп

1993; Mahler M., 1985). В целом, в пашем эксперименте вклад креатинфос-фата в энергообеспечение регенерирующей мышцы можно оценить как достаточно высокий. Период активации этого энзима самый продолжительный: с начала удлинения и до середины периода фиксации. Следует отметить, что угнетения общей активности КФК в начальный этап дист-ракции, которое мы наблюдали при исследовании энзимов ЦТК, отсутствует. Максимальная активность фермента обнаружена во второй серии (438%), а ее снижение выявлено в первой серии в период фиксации (61 %, р<0,05). По выраженности изменений серии животных располагаются таким образом: вторая - третья - первая; причем амплитуда между второй и первой достигает 300 %. Многие авторы связывают высокую активности этого фермента не только с эиергодающей функцией, но и непосредственно с синтезом миозина. В этом случае, биосинтетические процессы в мио-фибриллах наиболее активны во второй серии собак ( БДО, темп 2 мм).

Динамика активности КФК в мышце и сыворотке близка во второй и третьей сериях, а в первой - период гиперферментемии продолжительней чем в ткани.

Анализ литературы показал участие в энергообеспечении растущих мышц и пентозофосфатного пути, что и обусловило проведение специальных исследований. Однако, в отличие от ферментов гликолиза, цикла Крсбса и КФК, мы не обнаружили выраженный рост активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (ГлбФДГ). Одним из объяснений этому, вероятно, является незначительный синтез жирных кислот в мышце; несмотря на то, что рибоза, образуемая при окислении глюкозы по этому пути поступает для синтеза нуклеиновых кислот.

Особенности тканевого дыхании скелетной мышечной ткани.

Активация как НАД-, так и ФАД-зависимого окисления на этапе растяжения может играть определенную роль, поскольку эти коферменты обладают различным сродством к кислороду. С тем чтобы выяснить уровень оксигенации удлиняемой мышцы в нашем эксперименте, мы проанализировали динамику некоторых показателей тканевого дыхания. Эти исследования полностью подтвердили предположения о высоком вкладе аэробного окисления в биоэнергетику удлиняемой скелетной мышцы.

Динамика показателей тканевого дыхания дает основание считать, что в регенерирующей мышце при дистракциоппом остеосинтезе имеет место высокая скорость митохондриального окисления. Активация скорости эндогенного дыхания обнаружена у всех экспериментальных животных на протяжении всего этапа дистракции и вплоть до 60-и суток фиксации. Это дает основание считать, что в удлиняемой мышце происходит усиление аэробных процессов и увеличение в миофибриллах количества окисляющихся субстратов. Достаточно высокий уровень У.„1Д в два месяца фиксации (97%; 145%; 150%; р<0,05; первая - третья серии соотв.) совпадает с мнением ряда авторов, что именно в этот период в миоцитах развиваются процессы пролиферации и дифференцировки клеток, наиболее выраженные при БДО.

Сравнение показателей стимулирующего действия янтарной кислоты на препаратов, показывает, что в первой и второй сериях этот показатель увеличивается к концу этапа дистракции (137% и 136% соотв. сериям). Рост СДЯГГ на протяжении опыта может быть связан как с увеличением проницаемости мембран, так и с дефицитом эндогенного сукцината. Учитывая важную роль сукцината, обладающего большими энергетическими и пластическими потенциями, в адаптивных изменениях энергетического

Ткписнпг дыхание мышцы при уллпнонпм конечности

Исследуемые по каза-тсли Серия эксперимента Исходный уровень Конец дист-ракции 60 суток фиксации 180 суток фиксации

V.,,;,. Манатом 0;/МПМ МДО БДО( 1 мм) ЬДО(2мм1 2.0 + 0.1 11 10 3.0 ± 0,2'; 11 = 5 З.ч + 0.4'; п - 4 4.К £0.3\п = 6 2,7 + 0.2'; п = 6 3.0 + 0.2'; п = 6 3.1 ± 0,Г; п-10 , 2,0 + 0.1; п = 4 2,5+ 0,1';п - 15 1.5 1 0.2'. и -1

МДО БДО(Ым) БДО(2мм) 118.5 + 3.4 н = 10 137 1 4.8; 11 = 4 136 + 10.1;п = 4 113 + 5,0; п = 4 146 ± 11.0; п = 4 138+ 7,8; п = 4 138 + 6,7*; и = 4 176+15.2 .и - 3 130 + 8.1. ч = 8 146+13.1. п 3

СД„,.|,°о МДО БДО( 1 мм) БД0(2мм) 128.4 ¿г 3.7 п - 1н 110 + 8,3; п = 4 1051 7.0-, п = 3 105 ± 9.1; п = 3 143 ± 14.7; п = 3 105 + 6,9"; п = 4 120 + 8,3; п - 5 148+ 11.3; п = 3 120 + 5.7. п - 6 1 16+ Ю.1. и -■- 3

Амитал-резистентность. % мдо БДО(1мм) БД0(2мм) 53.5 + 2.9 п= 10 60 + 6.1; п = 3 60 ± 4,8; п = 3 67 ± 3,6*; п = 3 65 ± 5,0; п = 3 71 +5,9'; п = 3 75 + 5,9'; п = 3 80 + 7,5 ; и = 3 49 + 4.0; п -=■ <> 80 + 6.9'. п - 3

Мало-натре-шетен- ноетъ. % мдо БДО( 1мм) БД0(2мм) 47.5 ± 3.0 п = 10 61 + 4.0, п = 3 74 ± 6,9"; |1 = 3 64 ± 7.1; и = 3 45 ± 4,9; п = 3 66 + 7,0; п = 3 60 + 4.9, п = 4 34 + 6,0. и == 3 63 + 5.8; и = 6 38 ± 4,5: и = 3

* - р • 0.05 по сравнению с исходным уровнем

МДО - монолокальнын дистракционнын остсосннтсз БДО - онлокальнын днетракцнопньш остеосннтез V,,, ,- скорость эндогенного дыхания Сд„ - стимулирующее дейстпие янтарной кислоты С'Дн' - стимулирующее действие ДНФ

обмена, следует отметить, что рост окисления сукцината является необходимым при репаративном миогенезе.

Спектр субстратного окисления был различен. Наряду с глюкозой, ткань активно использует жирные кислоты, особенно, в период растяжения, и янтарную кислоту, значение которой возрастает в первой и третьей сериях, в то время как во второй серии к концу эксперимента увеличивается доля НАД-зависимых субстратов, что свидетельствует о более высоком уровне оксигенации в этой группе. В опытах с добавлением 2,4 ДНФ нами выявлено некоторое разобщение окисления и фосфорилирования, особенно на этапе удлинения у всех собак, а также в начале фиксации при БДО. Известно, что неполное окисление субстрата в митохондриях позволяет использовать интермедиаты как субстраты пластического обмена (Скулачев В.П., 1989). С другой стороны, механизм разобщения является признаком метаболической адаптации, который стимулирует рост скорости электронного потока, вследствие этого растет скорость синтеза АТФ. Для растущей ткани важно не столько само количество макроэргов, но и скорость их поступления.

Для оценки кислородтранспортных реакций использовали поляро-, графические методики: определение скорости локального кровотока (метод водородного клиренса) и напряжения Ог в мышечной ткани. При МДО установлена высокая скорость локального кровотока уже на 10-е сутки удлинения по отношению к мышечной ткани неоперированной конечности, где этот показатель оставался стабильным на протяжении всего эксперимента. С увеличением дистракции Улок.кр соответствовала таковой в мышце неоперированной голени.

При исследовании динамики напряжения кислорода в разные сроки удлинения найдено значительное увеличение до 158 % , которое затем

снижалось. Также установлено постепенное снижение величины максимального напряжения кислорода и показателя его прироста. Эти результаты указывают на изменения в состоянии микроциркуляторного русла. Рост показателей t| и tj на фоне их несущественных изменений в неоперирован-ной конечности показывают затруднение доставки кислорода к тканям, рост времени его доставки. Однако, уровень его утилизации не изменился (исходя из динамики показателей tj, (4), исключение составляют 20-е сутки дистракции, когда использование кислорода выросло в два раза. При рассмотрении результатов исследования VTOKKp и напряжения кислорода в ди-стракционном миогенезе выявили общую тенденцию нормализации этих показателей, за исключением, времени доставки 02. Некоторые ограничения во времени доставки кислорода в ткани вероятно, компенсированы скоростью локального кровотока, что позволяет сохранить уровень его утилизации.

Таким образом, мы можем объяснить выявленный морфологическими исследованиями низкий уровень кислорода его интенсивным использованием, особенно во второй серии. Существует предположение, что отношения между дыхательной цепью и синтезом определенных протеинов могут выступать как молекулярный механизм адаптации ткани к развитию гипоксии (Corbucci G.G. et al., 1995). Следует сказать, что кислород играет важную роль в регенерации мышцы, обеспечивая митохондриапьное окислительное фосфорилирование в качестве источника энергии и источника субстратов восстановительных синтезов.

С тем чтобы оценить состояние сократительного аппарата удлиняемых миофибрилл и физиологичность применяемых режимов дистракции, мы определяли активность Са2+ - зависимой АТФ-азы (первая и вторая серии животных). Достоверных различий в активности этого фермента не выявлено. Можно лишь отметить тенденции незначительного роста в первой половине дистракции и спада к концу удлинения при МДО и небольно

шой стимуляции АТФ-азной активности при БДО. Эти результаты свидетельствуют о сохранении сократительной способности удлиненных волокон во второй группе и небольшое угнетение в 90 суток дистракции и первой группе. Используя литературные данные, есть основание считать, что степень стимуляции анаэробного окисления коррелирует с уровнем активности этого фермента (Исакова Т.В., 1990); а небольшая гиперферментемия может быть связана со сдвигом равновесия между «красными» и «белыми» волокнами в сторону последних, хотя их устойчивость к действию повреждающих факторов остается спорной.

Исследования уровня глюкозы в мышце являются дополнительной характеристикой активности метаболических перестроек. Повышенные концентрации глюкозы присутствуют практически у всех животных на этапе удлинения (226%; 214%; 223%; р<0,05; первая - третья серии соотв.), далее снижаясь, за исключением второй группы собак, где оно оставалось повышенным при завершении эксперимента (126 %).

Применяя метод корреляционного анализа в целом удалось получить оценку регенерации скелетной мышцы с использованием показателей сыворотки крови. При различии между классами наиболее информативными оказались ИФ ЛДГСЬ1П, ПВКсьт, КФКШВ. Мы предлагаем следующую зависимость для оценки метаболической адаптации скелетной мышечной ткани:

к = (МДГС1„„ + КФКСШ - ЛДГШ„) х Н/М х МК/ПВК

При значение к > «-8,0» условия дистракции можно считать благоприятными для регенерации скелетной мышечной ткани, а мышцу способной выполнять свои функции. При значениях к < «-8», есть основания для изменения режима удлинения, либо приостановки дистракции на некоторое время, поскольку выбранный темп и метод дистракционного остеосин-теза не являются физиологичными в данном случае.

9 I

Таким образом, проведенное исследование показало стимуляцию гликолиза, цикла Кребса, тканевого дыхания и рефосфорилирования креа-тинфосфата в регенерирующей скелетной мышце при дистракционном ос-теосинтезе. Фазность исследованных параметров зависела от стадии эксперимента: активация при дистракции и тенденция нормализации при фиксации. Для таких показателей, как КФК, МДГ, ПВК во второй серии в период 2-4 месяца фиксации обнаружен второй пик, который может быть связан с окончательным созреванием миофибрилл и становлением функциональной активности ткани. Степень выраженности обнаруженных изменений прямо связна с темпом, величиной и методом растяжения мышцы.

ВЫВОДЫ

1. Удлинение голени до 50 % исходной величины методами монолокального и билокального дистракционного остеосинтеза вызывает значительные сдвиги в биоэнергетике регенерирующей скелетной мышечной ткани. Они выражаются стимуляцией гликолиза, аэробных окислительных реакций, тканевого дыхания и рефосфорилирования креатинфосфата.

2.Степень активации биоэнергетических путей непосредственно зависит от темпа, величины удлинения и метода остеосинтеза. Наиболее бла-

t

гоприятными оказались условия растяжения при билокальном дистракционном остеосинтезе с темпом удлинения 1 мм на каждом уровне. Метод монолокального дистракционного остеосинтеза целесообразно применять до величины 27-30 % удлинения.

3.Тип энергообеспечения зависит от стадии регенерации. Так, в начальный период удлинения решающее значение имеет гликолиз, при достижении 10-15 % удлинения - окисление НАД- и ФАД- зависимых субстратов, на этапе фиксации в аппарате - рефосфорилирование креатинфосфата.

4.Регенерация скелетной мышцы протекает на фоне активных ки-слородзависимых реакций, максимально выраженных в режиме билокаль-ного дистракционного остеосинтеза с темпом 1 мм в сутки на каждом уровне, что позволяет предотвратить развитие истинной гипоксии тканей, выявляемой гистологическими исследованиями.

5.Отсутствие существенных изменений в активности Са2+ - зависимой АТФ-азы указывает, что регенерация малоберцовой мышцы протекает без угнетения ее сократительной функции. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Влияние больших удлинений конечности на некоторые процессы энергетического метаболизма в мышечной ткани и сыворотке крови / Тез. докл. Республ. науч. конф. молодых травматологов-ортопедов, посвящ. 70-лстшо Великой Октябрьской социалистической революции, 24-25 сентября, 1987г. - Тбилиси, 1987. - С. 186-187. (соавт. А.И. Реутов).

2. Активность ЛДГ и МДГ сыворотки крови собак при билокальном дист-ракционном остеосинтезе по Илизарову / Дистракционный остеосинтез в клинике и эксперименте: Сб. науч. тр. ВКНЦ «ВТО». - Курган, 1988. -С. 122-128.

3. Некоторые показатели гликолитического и окислительного метаболизма в мышечной ткани голени и сыворотки крови собак при больших удлинениях // Новые методы теоретич. и практич. физиологии: Тез докл. I город. физиол. науч.- практ. конф. молодых ученых и специалистов, Свердловск, 25 декабря 1989. - Свердловск, 1989. - С. 31-33 (соавт. А.И. Реутов).

4. Влияние больших удлинений голени на активность основных метаболических систем скелетной мышцы // Комплексное лечение больных с тя-

желой скелетной травмой: Сб. науч. тр. ВКНЦ «ВТО». - Курган, 1989. -С. 56-59. (соавт. А.И. Реутов).

5. Регенерация скелетной мышечной ткани при удлинении конечности. Морфоэнергетические аспекты // Адапт.-компенсат. и восст. процессы в тканях опорно-двигательного аппарата: Тез. докл. VIII школы по биологии опорно-двигат. аппарата, Киев, 19-21 июня, 1990. - Киев, 1990. - С. 216-217. (соавтЛ.Н. Кочутина, A.B. Осипенко).

6. К вопросу о преимуществах применения метода билокального дистрак-ционного остеосинтеза по Илизарову при травме опорно-двигательного аппарата //V Всерос. Съезд травматологов-ортопедов, Ленинград, 2-4 октября 1990. - Ярославль, 1990. - Часть I. - С. 248-250. (соавт. Л.Н. Кочутина).

7. Биоэнергетические аспекты регенерации скелетной мышцы //Системные и клеточные механизмы адаптации организма к действию повреждающих факторов: Тез докл. конф. патофиз. Урала. - Челябинск, 1991. - С. 130-131 (соавт. A.B. Осипенко).

8. Влияние различной величины удлинения на энергетический обмен регенерирующей скелетной мышечной ткани // Гений ортопедии: спец. выпуск, посвящ. 25-летию РНЦ «ВТО». - 1996. - № 2-3. - С. 144-145. (соавт. A.B. Осипенко).

9. Активность креатиикиназы сыворотки крови в динамике дистракцион-ного миогенеза //Диагностика, лечение и реабилитация больных с повреждениями таза: Сб. стат. - Екатеринбург, 1996. - С. 104-107. (соавт. A.B. Осипенко).

10. Некоторые особенности метаболизма в тканях опорно-двигательного аппарата при дистракционном остеосинтезе //VI съезд травм.-ортоп.

России, 9-12 сентября 1997, Нижний Новгород: Тез. докл.- Нижний Новгород, 1997. - С. 457.(соавт. A.B. Осипенко, Л.Н. Кочутина, И.П. Кудрявцева).

11. Регенерация тканей: роль гипоксии и окислительного фосфорилирова-ния //Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Матер. Всерос. конф. - М., 1997. - С. 90. (соавт. A.B. Осипенко).