автореферат и диссертация по педагогике 13.00.01 для написания научной статьи или работы на тему: Природоохранительное воспитание учащихся в русской народной школе во второй половине XIX века

Автореферат диссертации по теме "Природоохранительное воспитание учащихся в русской народной школе во второй половине XIX века"

На нрлпах рукописи

ЕРМАК ИРИНА МИХАЙЛОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ С БЕЛКАМИ И ПОЛИСАХАРИДАМИ. МОДИФИКАЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ

02.00.10- биоорганическая химия Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Владивосток - 2006 г.

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор Каминский В.А

доктор химических наук профессор Книрель Ю.А.

доктор химических наук профессор Щеголев С.Ю.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Зашита состоится октября 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного

совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: science@piboc.dvo.ni

С диссертацией можно ознакомиться в филиале центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан "" сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник / / Прокопенко Г.И.

лъги

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Липополисахарид (ЛПС), специфический компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий, представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент (липид А) и ковалентно связанную с ним гидрофильную полисахаридную часть.

ЛПС играют важную роль во взаимодействии микро- и макроорганизма и являются мощными токсинами, которые получили название эндотоксинов.

В наружной мембране бактерий ЛПС специфически взаимодействуют с белками мембраны, образуя ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК) Эти комплексы играют важную роль в организации и функционировании бактериальной мембраны и в значительной степени определяют ее свойства ЛПБК представляет собой так называемый полный О-соматический антиген Буавена и при попадании в макроорганизм обеспечивает формирование иммунитета к бактериальному возбудителю. Долгое время считалось, что все основные свойства ЛПБК определяются ЛПС, пока не была установлена важная роль белкового компонента в модификации физиологической активности ЛПС. Комплекс обладает особыми биологическими свойствами, которые отсутствуют у отдельно взятых ЛПС и белка, но характерны для бактериальной клетки в целом.

Способность ЛПС образовывать комплексы с белками наружной мембраны бактерий подтверждена многими экспериментальными фактами, однако сведения о структуре и свойствах ЛПБК, их поведении в водных средах весьма ограничены. Поэтому изучение физико-химических свойств и макромолекулярной организации ЛПБК, а также его ЛПС составляющей, до сих пор остается актуальной и важной проблемой. Это обусловлено тем, что достаточно полно понять молекулярные механизмы биологического действия ЛПС и ЛПБК, можно лишь располагая соответствующими данными об их макромолекулярной организации

Взаимодействие ЛПС с веществами белковой природы не ограничивается только белками наружной мембраны бактерий. При попадании в макроорганизм ЛПС взаимодействуют с белками сыворотки и бактерицидными белками организма хозяина, а также являются мишенью для антибактериальных веществ поликатионной природы, используемых при лечении бактериальных инфекций В таком случае ЛПБК, выделенные из бактериальной мембраны, могут служить удобной моделью для изучения ЛПС-белковых взаимодействий

Сокращения, используемые в тексте- АДФ - аденозиндифосфат, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, ГПХ - гель-проникающая хроматография, ГЖХ - газожидкостная хроматография, ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, ДСН - додецилсульфат натрия, ИЛ - интерлейкин, КДО - 2-кето-3-дезокси-О-.ма««0-октоновая кислота, ЛПБК -липополисахарид-белковый комплекс, ЛПС - липополисахарид, Man - манноза, Hep -гептоза, ММР - молекулярно-массовое распределение, ПТИ - пищевая токсикоинфекция, ПААГ - полиакриламидный гель, РИА - радиоиммуноанализ, ТХУ - трихлоруксусная кислота, TLR - толлподобные рецепторы, CsCl - хлористый цезий, ЭДТА -этилендиаминтетраацетат »атрия, ФЧ - фагоцитарное число, ФП - фагоцитарный показатель, ФНО - фактор некроза опухоли, Х-ВМ и Х-НМ - хитозаны высокой и низкой молекулярных масс соответственно

РОС. НАЦИОНАЛЫ^*! БИБЛИОТЕК\ С -Пегсрбург ОЭ 200&кт?3/

Результатом специфического взаимодействия ЛПС с клетками макроорганизма является биосинтез активных медиаторов - цитокинов, гиперпродукция которых при высокой концентрации ЛПС приводит к развитию сложной гаммы токсических эффектов, таких как пирогенность, лейкопения, шок, объединяемых понятием «бактериальный эндотоксикоз» Открытие тонких молекулярных механизмов токсического эффекта ЛПС стимулировало появление новых подходов для нейтрализации его действия Один из них заключается в использовании веществ, нейтрализующих токсическое действие ЛПС на макроорганизм за счет образования с ним макромолекулярных комплексов Этот прием является достаточно специфическим, так как не нарушает механизмы защиты хозяина от патогена Для этих целей в последние годы активно исследуется взаимодействие ЛПС с несколькими классами катионных амфифильных молекул, включая белки, пептиды и синтетические полипептиды, для которых ЛПС является важной мишеныо, благодаря высокому отрицательному заряду за счет фосфатных, пирофосфатных и карбоксильных групп, локализованных во внутренней части кора и в липиде А - токсическом центре ЛПС.

Поиск природных веществ, снижающих негативное действие бактериальных эндотоксинов, повышающих неспецифическую резистентность организма к действию ЛПС и восстанавливающих работу иммунной системы организма, имеет важное значение. Среди веществ, способных нейтрализовать токсическое действие эндотоксинов, перспективными представляются полисахариды морского происхождения благодаря их разносторонней биологической активности, в том числе бактерицидной и иммуностимулирующей, их биосовместимости, безопасности и доступности. Особого внимания заслуживают два таких полисахарида: хитозан и каррагинан, первый - в силу его поликатионной природы, благодаря чему он может рассматриваться в качестве потенциального лиганда для ЛПС, а второй - как представитель класса пищевых волокон, играющих важную роль в гомеостазе и широко используемый в составе различных пищевых продуктов. Механизмы специфического и неспецифического взаимодействия ЛПС с полисахаридами на молекулярном уровне, как и их влияние на биологические свойства эндотоксинов не исследованы.

Изучение взаимодействия бактериальных ЛПС с белками и полисахаридами может внести вклад в понимание механизма биологического действия ЛПС, осуществляемого на уровне гуморальных и клеточных факторов макроорганизма, молекулярные основы которого остаются еще неясными.

Прикладное значение таких исследований заключается в том, что они открывают перспективу создания препаратов вспомогательной терапии при лечении септических осложнений грамотрицательных инфекций.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить взаимодействие ЛПС грамотрицательных бактерий с белками внешней мембраны бактерий и природными полисахаридами и установить влияние этих полимеров на физиологическую активность ЛПС.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить и охарактеризовать ЛПБК - комплекс ЛПС с мембранными белками псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotuberculosis,

- изучить надмолекулярную организацию ЛПБК и входящего в его состав ЛПС в различных водных средах;

- провести сравнительное исследование физиологической активности ЛПС и ЛПБК и определить её связь с физико-химическими характеристиками эндотоксинов;

- получить из природных источников препараты полисахаридов: каррагинанов и хитозана, - изучить их структуру и свойства;

- определить особенности взаимодействия ЛПС с хитозаном и константы их связывания;

- провести сравнительное изучение физиологической активности ЛПС и его комплексов с хитозаном;

- оценить взаимодействие ЛПС с каррагинаном;

- изучить влияние каррагинана на физиологическую активность ЛПС;

- оценить возможность использования полисахаридов для лечения осложнений, вызванных грамотрицательными бактериями.

Научная новизна работы

Впервые проведен сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств ЛПБК и ЛПС из У. pseudotuberculosis. Установлена важная роль белка в макромолекулярной организации комплекса и его физиологической активности.

Впервые на молекулярном уровне изучено взаимодействие ЛПС с хитозанами и установлено образование комплексов ЛПС - хитозан различной стехиометрии Изучен процесс комплексообразования и определены параметры связывания ЛПС с хитозанами.

Впервые в опытах in vivo установлено снижение токсичности ЛПС при образовании им комплекса с хитозаном и обнаружена модификация физиологической активности ЛПС под действием хитозана в опытах in vitro.

Впервые установлена зависимость структуры сульфатированных полисахаридов каррагинанов, выделенных из красных водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae, от стадии развития водоросли и изучены физико-химические свойства каррагинанов.

Впервые исследовано взаимодействие каррагинанов с бактериальными ЛПС и установлен ингибирующий эффект каррагинана на токсическое действие ЛПС в опытах in vivo.

Впервые в опытах in vivo установлено, что макроорганизм под влиянием хитозана и каррагинана способен противостоять действию бактериального эндотоксина.

Практическая значимость

Показано, что ЛПБК обусловливает возникновение и развитие инфекционного процесса при псевдотуберкулезе.

Предложен метод существенного снижения токсического действия ЛПС путем образования комплекса с хитозаном.

На уровне целостного организма получены данные о защитном действии хитозана и каррагинана при ЛПС-индуцируемой эндотоксинемии, что открывает перспективы их использования в клинической практике для связывания и детоксикации ЛПС.

Обоснована возможность внедрения терапии пищевых токсикоинфекций (ПТИ) с помощью природных полисахаридов' каррагинана и хитозана, - для коррекции нарушений тромбоцитарного звена гемостаза.

При использовании каррагинана в добавлении к базовой регидратационной терапии получен положительный эффект на систему гемостаза, иммунного статуса и на некоторые биохимические параметры, характеризующие состояние гомеостаза, в условиях эндотоксинемии у больных ПТИ сальмонеллезной этиологии.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых подходов с использованием полисахаридов для снятия интоксикационного синдрома у септических больных

Разработаны и утверждены ТУ № 9284-037-02698170-99 от 21.06 99 г на получение каррагинана из водоросли Chondrus armatus в качестве пищевой добавки.

На защиту выносятся следующие результаты и положения

1. В наружной мембране псевдотуберкулезного микроба У. pseudotuberculosis ЛПС тесно связаны с белками мембраны и образуют с ними ЛПБК, состав которых зависит от условий культивирования бактерий

2. Физико-химические свойства и физиологическая активность ЛПБК определяются как ЛПС-составляющей комплекса, так и его белковым компонентом.

3. ЛПС образует с хитозанами комплексы различной стехиометрии. Макромолекулярная организация ЛПС играет важную роль при его взаимодействии с поликатионами.

4. Процесс взаимодействия ЛПС с хитозанами зависит от структурных особенностей взаимодействующих компонентов и условий проведения реакции связывания.

5. ЛПС взаимодействует с каррагинаном, и этот процесс зависит от структуры используемого каррагинана.

6. Структура каррагинана определяется как видовой принадлежностью водоросли, так и стадией ее развития.

7. Полисахариды хитозан и каррагинан, - нейтрализуют токсическое действие ЛПС и сохраняют его иммунобиологические свойства.

8. Хитозан и каррагинан могут быть могут быть полезными в качестве препаратов вспомогательной терапии при лечении эндотоксинемии

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены лично автором в виде устных сообщений на- Всесоюзной конференции «Бактериальные токсины» (Юрмала, Латвия, 1989); II Всесоюзном семинаре «Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов» (Саратов, 1991); International Symposium "Chemical Natural products" (Tenerife, Spain, 1996); Первом международном симпозиуме «Натуральные биокорректоры питание, здоровье, экология» (Москва, 1997); XVI International Seaweed Symposium (Cube, Philippine, 1998); International Symposium «Biotechnology of Marine Algae and Marine Bioactive Substances» (Qindao, China, 2000); 2rd German-Polish - Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Moscow, 2002); Конференции «Фундаментальные науки - Медицине» (Москва, 2003); XVII International Seaweed Symposium (Bergan, Norway, 2004); A satellite to the XVII International Seaweed Symposium «Marine Biopolymers» (Trondheim, Norway, 2004); 3rd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Wroclaw, Poland, 2004), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 46 статей в отечественных и международных журналах и более 50 тезисов докладов

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, восьми глав с изложением результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 445 источников Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста, содержит 58 рисунков и 30 таблиц

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета Отдела молекулярной иммунологии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН В основу работы положены исследования, проведенные в период 1985-2005гг в рамках научных программ плановой темы НИР «Изучение молекулярных основ иммунных процессов, в том числе антибактериального и антиопухолевого иммунитета».

Частично работа получила финансовую поддержку Министерства науки и технической политики ГНП № 402-15 2 18 (8.114), ГНП № 41.028.112447 (02.04.14); Российского фонда фундаментальных исследований №97-04-48238-а, №01-04-96920, №05-04-49901-3, РФФИ-ГФЕН, (№ 99-04-10004), фонда CRDF, Президиума РАН «Фундаментальные науки - Медицине», «Молекулярная и клеточная биология» и Президиума ДВО РАН №05- 1IIA-05-041, № 06-2У-0-05-009, № 06-04-96022.

Автор выражает свою искреннюю благодарность научным консультантам, академику РАН Ю.С Оводову и проф. д.х.н.Т Ф. Соловьевой, - за неустанное внимание к работе, ценные консультации и полезные советы, за совместное обсуждение отдельных положений работы, их тщательный анализ и добрую критику. Автор приносит глубокую признательность за всестороннюю помощь в работе всем сотрудникам ЛМОАБИ и, в частности, к.х.н. В.Н Давыдовой, к.х н. В.И Горбачу, к.х н АО. Барабановой, к.х н. Г. А Набережных, к х.н. И Н Красиковой, а также сотрудникам ТИБОХ - к.ф-м.н. В.П Глазунову, д б.н. A.B. Реунову, к.б н. Л.А Лапшиной, к.х.н Е.Л Назаренко , к.х.н. В.В Исакову, д х н. П А. Лукьянову, к.х н Г.М. Фроловой. Автор также благодарит за сотрудничество в работе сотрудников ИБМ ДВО РАН к.б н Э.И. Хасину, д.б.н. Э.А Титлянова, д.б.н А.Л. Дроздова, д ф-м н. В Г. Заводинского, сотрудников ЦНИЭМ МЗ (г Москва ) д.б.н. А.М Полякову, к.б.н. О.П. Астрину, академика РАМН В.В. Малеева и сотрудников НИИЭМ РАМН (г. Владивосток) академика РАМН H.H. Беседнову, к б.н. Т.Н. Запорожец, к.б н. Т А Кузнецову. Автор выражает признательность чл,-корр. РАН В.Е Васьковскому за доброжелательное отношение, советы и поддержку работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из 6 разделов, приведено описание строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий и ее основного структурного компонента - ЛПС, дана характеристика макромолекулярной организации ЛПС и его поведению в растворах, описаны комплексы ЛПС с белками наружной мембраны и проанализирована связь структуры и

физиологической активности ЛГТС, подробно изложены вопросы взаимодействия ЛГГС с белками макроорганизма, в том числе сывороточными, такими как липопротеины, глобулин, альбумин, бактерицидными и ЛПС-связывающими белками, и приведены примеры детоксикации ЛПС; рассмотрены структурные особенности и физико-химические свойства используемых в работе полисахаридов - хитозанов и каррагинанов.

Обсуждение результатов

ЛПС и ЛПБК из Yersinia pseudotuberculosis

Среди широкого набора методов выделения ЛПБК наиболее распространенной является экстракция с помощью ТХУ и ЭДТА Обычно используемый при экстракции эндотоксинов водный фенол разрушает комплекс между ЛПС и белком и оказывает деградирующее действие Важно было определить, какая часть ЛПС экстрагируется в виде комплекса с белком, и сравнить ЛПС, входящий в состав комплекса, с ЛПС, выделенным из клеточной стенки при обработке бактерий водным фенолом. С этой целью клетки псевдотуберкулезного микроба (серовар 1 В, штамм 598) последовательно обрабатывали раствором ТХУ, NaHCOj и ЭДТА согласно схеме, приведенной на Рис 1. Остаток бактериальной массы обрабатывали горячим водным фенолом и получили ЛПС-1, содержащий 1% белка Параллельно этим же методом из исходной бактериальной массы получали ЛПС-П и очищали от сопутствующих примесей центрифугированием в градиенте CsCl Экстракты ТХУ, NaHCO^ и ЭДТА очищали от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией на колонке с сефарозой 2В, а затем изоплотностным центрифугированием в градиенте CsCl Совпадение максимумов выходных кривых по белку и по КДО - специфический моносахаридный остаток, входящий в состав ЛПС, свидетельствует о том, что экстракты ТХУ, ЭДТА и NaHC03 содержат ЛПБК (Рис 26). Все выделенные ЛПБК имеют одинаковую плотность 1.41г/см3, отличную от плотности ЛПС (Табл. 1). Соотношение компонентов моносахарид-белок во всех ЛПБК одинаково (2' 1 в/в), белковый компонент идентичен и по данным ДСН-ПААГ электрофореза представлен двумя полипептидами с молекулярными массами 40 и J 4,5 кДа.

Все полученные ЛПБК и ЛПС имеют одинаковый моносахаридный состав, идентичный установленному ранее для ЛПС из псевдотуберкулезного микроба, однако мольное отношение маннозы к гептозе, характеризующее размер О-специфической полисахаридной цепи, различается для ЛПС и ЛПБК В ЛПБК О-полисахаридный фрагмент, в среднем, длиннее, чем в ЛПС ЛПС-1 имеет более короткую углеводную цепь, чем ЛПС-П. Эти данные хорошо согласуются с результатами электрофореза, которые показывают, что после обработки микробной массы ТХУ, NaHC03 и ЭДТА в клетках преимущественно остается ЛПС с короткой цепью.

Следует отметить, что если при выделении ЛПБК исключить стадии диализа и лиофилизации экстрактов, то после гель-фильтрации каждый из них (например, ТХУ) при изоплотностном центрифугировании делится на две фракции ЛПБК с плотностью 1,40 и 1,43 г/см3, обозначенные для ЛПБК-А, как ЛПБК-А, и ЛПБК-А2 (Рис. 2а).

45% 5%

ФЕНОЛ ТХУ

0,1М NaHCOj рН 10.7

NaHCOs О 1M3DTA

45% ФЕНОЛ

Микробная масса

Л ПС-И

л/

Микробная масса

Остаток клеток -1

Остаток клеток-2

Остаток клеток -3

ЭКСТРАКТ ЭКСТРАКТ ТХУ NaHCOj

ЭКСТРАКТ ЭДТА

ЛПС-1

_L

I I

Гельфильтрация на сефарозе 2В

ю

V.

Изоплотностное центрифугирование в градиенте плотности CsCl

ЛПС - II

V

ЛИБК-А ТХУ

-V—

ЛПБК-NaHCO

V— ЛПБК -ЭДТА

ЛПС-1

Рис. 1. Схема выделения ЛПБК и ЛПС из псевдотуберкулезного микроба

Эти комплексы (ЛПБК-А, и ЛПБК-А2) отличаются соотношением полисахарида и белка, что обусловливает разницу в их плотности. Смесь этих комплексов после диализа и лиофилизации не удается разделить центрифугированием. Вероятно, процесс лиофилизации способствует их гибридизации и образованию промежуточной формы ЛПБК со средней плотностью гидратации (1,41 г/см3).

Таблица 1. Выход и характеристика ЛПБК и ЛПС после очистки в градиенте

плотности СбС1

ЛПБК-А (ТХУ) ЛПБК NaHC03 ЛПБК ЭДТА ЛПС-1 ЛПС-П

Плотность (р) CsCl г/см3 1,41 1,41 1,41 1,44 1,43

Man/Hep Моль/Моль 5,0 5,0 5,0 1,8 2,5

Выход, % от микробной массы 0,65 0,05 0,58 0,74 1,3

tb«peifcs*u« Номере cfcpaa+ii 6

Рис.2. Центрифугирование в градиенте СбСР а - ЛПБК-А - экстракт ТХУ без лиофилизации; б - ЛПБК-А - экстракт ТХУ после лиофилизации и диализа

Как известно, химический состав бактерий во многом определяется параметрами среды обитания, важнейшим из которых является температура Для изучения влияния температуры культивирования бактерий на состав ЛПС и ЛПБК У.рзеис1ошЬегси1о5 '1з (шт 2602) выращивали при трех температурных режимах: 4°С , 20°С и 37°С Выделение и очистку ЛПС и ЛПБК проводили, как описано выше Как показали результаты, выход ЛПБК и ЛПС зависит от температуры культивирования бактерий, резко уменьшаясь при ее повышении Чем ниже температура культивирования бактерий, тем более длинные в среднем О-специфические цепи имеет ЛПС, что следует из результатов химического анализа (Табл 2). Электрофорез ЛПС в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием ионами серебра подтверждает приведенные выше результаты ЛПС - 37°С в отличие от ЛПС - 4°С не содержит молекул с длинными О-цепями Как видно из таблицы 2, ЛПБК и ЛПС, выделенные из клеток, выращенных при 20°С и 37°С, гетерогенны по плотности, в отличие от ЛПБК - 4°С и ЛПС - 4°С

Таблица 2 Выход и характеристика ЛПС и ЛПБК из бактерий У pseudotuberculosis, выращенных при различных температурах

Вещество Выход, % Плотность (р) в Выход, % от мик- Man/Hep,

от CsCl, г/см3 робной массы Моль/Моль

микробной после центрифу-

массы гирования в СбС1

ЛПС - 4°С 1,9 1,43 1,4 2,5

ЛПС - 37°С 0,8 1,45 0,48 1,0

1,43 0,02 2,5

ЛПБК - 4"С 0,9 1,40 0,60 6,5

ЛПБК - 37иС 0,2 1,43 0,01 3,0

1,41

ЛПБК - 20иС 0,7 1,43 0,14 3,2

1,40 0,25

Температура культивирования оказывает влияние на содержание О-антигенов на поверхности бактериальных клеток, что было установлено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа Бактерии, выращенные на холоду, имеют на поверхности больше доступных О-полисахаридных детерминант, по сравнению с клетками, культивируемыми при 37°С

Таким образом, из бактерий Y. pseudotuberculosis традиционными методами экстракции могут быть выделены как ЛПС, так и ЛПБК Последовательная обработка бактериальной массы ТХУ и ЭДТА позволяет увеличить выход ЛПБК в 2 раза, при этом не извлеченным остается половина ЛПС, который экстрагируется горячим водным фенолом. В каждом из ТХУ и ЭДТА экстрактах присутствуют две фракции ЛПБК, которые в процессе лиофилизации образуют усредненную или гибридную форму. Выделенные различными реагентами и очищенные (после лиофилизации экстрактов) ЛПБК имеют идентичный химический состав, одинаковое соотношение компонентов (полисахарид • белок) и их полисахаридный фрагмент имеет один и тот же средний размер О-специфических цепей В составе комплекса ЛПС имеет в среднем более длинную О-специфическую углеводную цепь, по сравнению с ЛПС, выделенным из бактериальных клеток горячим фенолом Эта закономерность сохраняется независимо от температуры роста бактерий и становится более ярко выраженной при низкой температуре культивирования Y. pseudotuberculosis.

Анализ собственных и литературных данных позволяет предположить, что во внешней мембране псевдотуберкулезного микроба присутствуют два типа ЛПС, которые занимают различное положение в мембране ЛПС с более длиной О-специфической углеводной цепью находится в тесной ассоциации с белком и экстрагируется в виде ЛПБК ЛПС с более короткой О-цепью, вероятно, участвует в образовании «чистых» ЛПС-фосфолипдных бислоев внешней мембраны и экстрагируется фенолом как более жестким реагентом

Уменьшение размера О-цепей в ЛПС бактерий, выращенных при 37°С, может вносить определенный вклад в потерю им вирулентности, поскольку известно, что О-полисахарид в значительной степени отвечает за устойчивость бактерий против защитных факторов макроорганизма.

Физико-химические свойства ЛПБК И ЛПС из Y. pseudotuberculosis Физико-химические свойства ЛПБК практически не изучены, а данные о поведении ЛПС в водных растворах весьма противоречивы Изучение физико-химических свойств как ЛПБК, так и ЛПС осложняется в силу их особенностей: слабой растворимости, полидисперсности и способности, вследствие амфифильной природы их молекул, образовывать в растворах агрегаты, что накладывает определенные ограничения на применение физико-химических методов исследования и затрудняет интерпретацию полученных результатов В связи с этим, такие параметры, как молекулярная масса, размер и форма характеризуют не макромолекулы полимера, а формируемые в растворе агрегаты ЛПС и ЛПБК

Для изучения поведения ЛПС и ЛПБК в водных растворах и определения их физико-химических характеристик в данной работе были использованы дополняющие друг друга методы- аналитическое равновесное и скоростное центрифугирование, гель-проникающая хроматография па макропористых стеклах (ГПХ), вискозиметрия, светорассеяние и электронная микроскопия Совокупность полученных данных позволила с достаточной степенью достоверности определить физико-химические параметры эндотоксинов, а параллельное изучение ЛПС и

ЛПБК позволило оцепить вклад ЛПС составляющей в макромолекулярную организацию комплекса.

Исследование проведено на образцах ЛПБК-А и ЛПС, которые были выделены из бактерий Y.pseudotuberculosis, выращенных при 4°С Все образны по данным равновесного центрифугирования гомогенны по плотности и образуют одну границу седиментации при аналитическом центрифугировании

MEW(M) CH/R0x(l+cos2e/2sin9)107

Рис 3. Молекулярно- массовое распределение для ЛПБК в 0,1М NaCl - а, 0,03М трис-HCl (рН 8) - б, воде - с

Экстраполяционные зависимости построены с учетом данных трех (1), четырех (2,4) и пяти (3) концентраций

Молекулярно-массовые параметры ЛПБК в растворах определяли методом ГПХ на макропористых стеклах. Относительная площадь каждого хроматографического пика (в процентах) и соответствующие значения М», вычисленные по скорректированной на функцию приборного уширения хроматограмме, приведены в таблице 3 Многомодальность молекулярно-массового распределения (ММР) ЛПБК, наблюдаемая этим методом (Рис. 3), указывает на существенную полидисперсность ЛПБК, что обусловлено образованием в растворе агрегатов, размеры которых зависят от концентрации полимера и условий растворения (Табл. 3). С увеличением ионной силы раствора и уменьшением концентрации полимера наблюдается снижение степени полидисперсности и размеров агрегатов. ЛПС, по сравнению с ЛПБК, образует агрегаты больших размеров (Табл. 3) Сравнение молекулярно-массовых параметров, полученных для разных концентраций полимера, показывает, что М„ агрегатов с точностью до ошибки эксперимента кратны некоторой постоянной величине, условно обозначенной М0 и равной 0,18 МОа для ЛПБК в ОДМ №С1 буфере и 0,26 МЭа в воде Зависимость содержания низко- и высокомолекулярных агрегатов в растворе от концентрации ЛПБК свидетельствует об обратимом процессе: агрегации- дезагрегации.

Таблица 3. Средневесовые молекулярные массы (М„) и содержание (Р) агрегатов ЛПБК и ЛПС в растворах в зависимости от концентрации полимера (С) и природы растворителя

Растворитель Вещество С м„ Р,% Р, м„ Р,% м„ Р,%

мг/мл МДа МДа % МДа МДа

Вода ЛПБК-А 2,0 55 71 - 0,26 29

2,5 270 18 58 12 1 70 -

0,03 М ЛПБК-А 2,0 14 53 1,2 35 0,45 6

трис-НС1 рН 8 2,5 13 64 2,0 18 0,64 20

0.1М ИаС1 ЛПБК-А 0,5 - - 3,1 23 0,18 76

2,0 15 68 3,0 24 0,75 4

0.1М№С1в ЛПБК-А 1,0 - - - 3,2 47 0,18 10

о,озм - 1,8 39

трис-НС1 рН8 ЛПС 1,0 15 62 2,7 0,75 38

Полученные результаты полностью согласуются с данными метода светорассеяния. Для растворов ЛПБК большинство графиков угловой зависимости двойной экстраполяции (Зимма) имеют в-образную форму, что может быть обусловлено полидисперсностью исследуемых образцов и/или присутствием в растворе частиц с характеристическим размером, большим длины волны падающего света (Рис. 4). Рассчитанные этим методом значения средневесовых молекулярных масс для разных концентраций ЛПБК находятся в пределах 4-14 МДа, а /-средние значения радиуса инерции частиц при этом равны 66 - 130 нм. С увеличением ионной силы раствора наблюдается образование меньших по размеру агрегатов ЛПБК, а разбавление растворов ЛПБК вызывает диссоциацию агрегатов, сопровождаемую изменением их формы, в сторону более компактных.

Для определения достоверных значений средневесовых (Мш) и г-средних (М7) молекулярных масс ЛПБК и ЛПС с учетом их концентрационной зависимости были использованы методы аналитического центрифугировании: низкоскоростной метод равновесной седиментации и метод неустановившегося равновесия (Арчибальда). Для ЛПБК и М2 составляют 1,3 и 2,1 МДа, а для ЛПС - 2,9 и 4,0 МДа соответственно. Полученные существенные различия значений М» и М 2 указывают на полидисперсность исследуемых полимеров в растворе. М» ЛПБК почти в 2 раза меньше М„ ЛПС. Концентрационная зависимость молекулярной массы ЛПБК, описываемая квадратичным полиномом второго порядка (Рис. 5 (1)), как и анализ данных равновесного центрифугирования, свидетельствует о самоассоцииации частиц ЛПБК в растворе. В пользу этого говорит и существенное увеличение коэффициента седиментации ЛПБК с возрастанием его концентрации В отличие от ЛПБК для ЛПС наблюдается линейная концентрационная зависимость молекулярной массы (Рис. 5(2)), и коэффициент седиментации незначительно зависит от концентрации полимера, что характерно для невзаимодействующих систем

Рис 5 Зависимость ЛПБК и ЛПС от концентрации ЛПБК в растворе' 0,03М трис-НС1 (рН 8) (1), в 0,2% дезоксихолата 1Ча/диализ Н20 (3), 0,8% саркозилата N3 (4), 6М мочевины (5); ЛПС в растворе 0,03М трис-НС1 (рН 8) (2)

Превышение в 2 раза молекулярной массы ЛПС, по сравнению с ЛПБК, можно объяснить более сильным гидрофобным взаимодействием между молекулами ЛПС. Вероятно, в ЛПБК это взаимодействие ослаблено белковым компонентом, который, как известно, связан с липидной частью и может экранировать гидрофобные участки ЛПБК

Для ЛПС и ЛПБК были определены гидродинамические параметры характеристическая вязкость и коэффициент трения, - которые тесно связаны с конформацией полимера в растворе. Для этого были получены шесть фракций ЛПБК при фракционировании его гель-фильтрацией на колонке с сефарозой 2В Характеристическая вязкость (т|) ЛПБК-А в воде имеет довольно высокое значение (около 260 см3/г) и существенно уменьшается с увеличением ионной силы раствора (до 29 см3/г в 0,1 М ИаС1). Значительная зависимость этого параметра наблюдается от концентрации ЛПБК и времени его растворения - при длительном выдерживании растворов полимера (до трех суток) вязкость уменьшается до 6070% первоначальной величины, что, вероятно, является результатом диссоциации агрегатов ЛПБК, происходящей при разбавлении его растворов в течение достаточно длительного времени Подобная диссоциация агрегатов ЛПБК в процессе разбавления также наблюдалась при исследовании его растворов методами светорассеяния и ультрацентрифугирования

Низкие значения характеристической вязкости при большой молекулярной массе ЛПБК характерны для компактных частиц, близких к сферическим Из логарифмической зависимости характеристической вязкости от молекулярной массы (определенных для шести фракций ЛПБК) были найдены константы "а" и "К" из уравнения Марка-Куна-Хаувинка- ([т|] = К х Ма), значения которых (а=0,57 и К=5,5 х 104) позволяют с определенным приближением аппроксимировать форму частиц ЛПБК моделью компактного непроницаемого клубка В пользу такой формы частиц ЛПБК в растворе говорит и близкое к единице отношение коэффициентов трения f/fo, вычисленных на основании экспериментальных данных скоростного и равновесного центрифугирования (Табл. 4). Кроме того, значение коэффициента р, рассчитанное из уравнения Шераги-Манделькерна (оно приблизительно равно 2,12 х 106), исключает жесткую стержнеобразную форму частиц ЛПБК

ЛПС, в отличие от ЛПБК, образует агрегаты асимметричных форм (Шо =6,5)

а б в

Рис. 6. Электронная микрофотография ЛПБК и ЛПС из У pseudotuberculosis-а - ЛПБК в воде; б - ЛПБК в трис-HCl буфере (рН 8,0); в - ЛПС в трис-НС1 буфере (рН 8,0); окрашивание уранилацетатом. Масштаб: 1см=100 нм

Полученные гидродинамические параметры ЛПБК и ЛПС вполне сопоставимы с результатами электронно-микроскопического исследования макромолекул методом негативного контрастирования. Как видно из рис 6, ЛПБК в воде формирует частицы в виде везикул с размерами от 60 х 5 до 200 х 10 нм (Рис. 6а), а в растворе 0 03 М трис-HCl буфера (рН 8,0)-сферические частицы со средним диаметром 20 нм (Рис. 66). В отличие от ЛПБК, ЛПС из псевдотуберкулезного микроба, подобно ЛПС из других бактерий, проявляет значительный полиморфизм, образуя частицы в виде лент, пластинчатых структур, дисков (Рис. 6в)

Агрегация ЛПБК и ЛПС в водных растворах происходит за счет нековалентных взаимодействий В связи с этим было исследовано влияние различных диссоциирующих агентов на надмолекулярную структуру ЛПБК и ЛПС. Как показали результаты аналитического центрифугирования, при действии детергентов (саркозилата натрия и дезоксихолата натрия) происходит диссоциация частиц ЛПБК и ЛПС до субъединиц, характеристики которых приведены в таблице 4. Существенное уменьшение молекулярной массы и констант седиментации ЛПБК и ЛПС, обработанных детергентами, подтверждает важную роль гидрофобного взаимодействия в образовании высокомолекулярных агрегатов Дезагрегация макромолекул ЛПБК сопровождается изменением форм частиц, что видно из увеличения отношения коэффициентов трения (Табл. 4), и согласуется с данными электронной микроскопии- в присутствии детергента ЛПБК образует стержни и диски. Обработка ЛПБК дезоксихолатом натрия и последующее удаление детергента вызывают реагреганию субъединиц эндотоксина Линейный характер концентрационной зависимости молекулярной массы и коэффициента седиментации ЛПБК говорит об образовании менее полидисперсных, по сравнению с исходными, частиц ЛПБК, слабо взаимодействующих в растворе (Рис 5 (3)).

Таблица 4 Физико-химические характеристики ЛПБК и ЛПС в различных водных средах по данным аналитического центрифугирования

Вещество Добавки к буферу Плотность (р), г/см Mw, МДа SzowX 10 13 f/f Форма (электронная микроскопия)

ЛПБК Трис-НС 1 буфер, рН8 1,1 1,3 26 1,2 сферы 20-нм

ЛПБК 0,8% саркозилат Na 1,32 0,12 2,4 2,7 тонкие нити

ЛПБК 0,005 М ЭДТА 1,41 0,7 5,1 5,1 Диски,стержни

ЛПБК 6М мочевина 1,41 0,2 5,8 1,7 ц/о

ЛПБК 0,2% дезокси- холат Na/ диализ (Н20) 1,38 1,03 20,8 1,5

ЛПС Трис-НС 1 буфер, рН8 1,45 2,9 11,5 6,5 ленты, диски ламеллы

ЛПС 0,8% саркозилат Na 1,36 0,15 - - н/о

ЛПС 0,2% дезоксихолат Na 1,42 0,10 4,0 2,2 н/о

р - плотность в СвСТ , Эго^-константа седиментации, М„,- средневесовая молекулярная масса, Ш- отношение коэффициентов трения

Уменьшение молекулярной массы и константы седиментации ЛПБК и ЛПС наблюдается также в случае удаления части двухвалентных ионов при диализе растворов эндотоксинов против ЭДТА, при этом отношение коэффициентов трения возрастает, что свидетельствует об образовании более асимметричных структур. Мочевина также вызывает разукрупнение агрегатов ЛПБК (Табл 4), что указывает на участие в их образовании водородных связей Как показывают данные скоростной седиментации и изоплотностного центрифугирования, детергенты, мочевина и ЭДТА вызывают общую диссоциацию агрегатов ЛПБК, но не приводят к диссоциации комплекса на составляющие его компоненты ЛПС и белок.

Существенное влияние на размер, форму и поведение частиц ЛПБК и ЛПС в растворе оказывает температура Значения молекулярных масс и коэффициентов седиментации, а также величины коэффициентов трения, рассчитанные на основании данных седиментационного анализа, приведены в таблице 5 Температурные зависимости всех физико-химических параметров ЛПС и ЛПБК в исследуемом диапазоне температур (5°С - 47°С) имеют достаточно сложный характер Значения молекулярных масс ЛПС и ЛПБК с увеличением температуры вначале возрастают, а затем резко уменьшаются. Наиболее крупные агрегаты с высокой степенью асимметрии образуются при 30°С, (Табл. 5), что хорошо согласуется с данными электронной микроскопии Как видно из рис 7, ЛПБК, выдержанные при 30°С, под электронным микроскопом проявляются в виде ассоциированных структур ЛПС образуют плотно упакованные лентоподобные структуры.

Рис 7 Электронная микрофотография ЛПБК (а) и ЛПС (б) из У р5еис1о1иЬепик)ы\ в 0,1 М №С1 Образцы выдержаны при 30°С Окрашивание 2% ФВК (рН7) . Масштаб-1см=100нм

Дальнейший подъем температуры сопровождается уменьшением размера агрегатов. Повышение температуры от 37°С до 47°С вызывает разукрупнение частиц, а также уменьшение степени полидисперсности и самоассоциации исследуемых образцов.

Характер изменения молекулярной массы и коэффициентов седиментации ЛПБК от температуры, в основном, подобен наблюдаемому для ЛПС Однако определенные отличия в поведении ЛПС и ЛПБК существуют, особенно при низкой и высокой температуре Концентрационные зависимости молекулярных масс ЛПС при всех температурных,режимах носят линейный характер, в то время как для ЛПБК при 5°С и 20°С эти зависимости описываются нелинейными квадратичными полиномами Нелинейный характер зависимости свидетельствует о самоассоциации частиц ЛПБК в области низких температур Действительно, при переходе от 5°С к 20°С наблюдается резкое увеличение молекулярной массы ЛПБК, в то время как для ЛПС она изменяется незначительно При температуре выше 37°С значения молекулярных масс и степень асимметрии частиц ЛПБК больше, чем для ЛПС Изменение параметров частиц при изменении температуры, вероятно, является следствием термотропных фазовых переходов в эндотоксинах. Анализ зависимости физико-химических параметров от температуры позволяет предположить наличие в ЛПБК нескольких структурных переходов в области 5°С -47°С. Первые два (выше 20°С и выше 30 С) обусловлены ЛПС-составлющей комплекса, а последний (около 37°С) связан с белковым компонентом. Существенный вклад белкового компонента проявляется и в области низких температур (5°С-20°С). Сопоставление полученных результатов с литературными данными позволяет предположить, что переходы выше 20°С и в области 30°С вызваны гидратацией молекул ЛПС и плавлением липидной составляющей соответственно.

Таблица 5. Физико-химические характеристики ЛПБК и ЛПС при различных температурах

Температура (°С) Яох Ю"" Мж МДа т0

ЛПС ЛПБК ЛПС ЛПБК ЛПС ЛПБК

5 4,0 13,7 1,74 0,31 12,0 1,21

20 11,5 26,0 2,31 1,30 6,5 1,15

30 2,2 4,5 6,00 1,50 61,0 10,8

37 8,5 8,9 0,35 0,66 2,37 3,1

47 17,2 2,4 0,29 0,15 1,19 4,2

Результаты, полученные методом центрифугирования, согласуются с данными светорассеяния - с повышением температуры изменяется конформация и уменьшаются размеры частиц ЛПБК

Таким образом, данные, полученные различными физико-химическими методами, характеризуют агрегаты ЛПБК как в высокой степени динамичные самоассоциирующие структуры- их форма, размер, молекулярно-массовое распределение и ультраструктура зависят от концентрации полимера, времени его растворения, ионной силы и температуры раствора ЛПС образуют более крупные, по сравнению с ЛПБК, агрегаты, не склонные к самоассоциации.

Низкомолекулярные соединения, такие, как детергенты, мочевина и ЭДТА вызывают разукрупнение частиц ЛПБК и ЛПС Следовательно, силы, стабилизирующие макромолекулярную организацию агрегатов эндотоксинов, имеют различную природу- гидрофобное взаимодействие, водородные и ионные связи. Важную роль в архитектонике макромолекул ЛПБК и ЛПС играют ионы двухвалентных металлов, главным образом, кальция и магния Существенное влияние на размер, форму и поведение эндотоксинов в растворе оказывает температура Изменение параметров частиц ЛПБК и ЛПС при повышении температуры, вероятно, является следствием термотропных фазовых переходов в этих полимерах Эти переходы могут быть физиологически значимыми, так как их значения лежат в температурном интервале, в котором псевдотуберкулезный микроб, являющийся психрофилом, нормально живет и размножается

Обращает на себя внимание тот факт, что молекулярные массы агрегатов ЛПБК и ЛПС в растворах с разной концентрацией, ионной силой и температурой кратны некоторым величинам М0 В растворах преобладают агрегаты с Mw =20-30 Mo, 12М0, 5М0,2М0 Это позволяет предполагать, что большие агрегаты, подобно агрегатам некоторых амфифильных соединений, построены из «субъединиц» (первичных агрегатов) Первичные агрегаты, сформированные за счет гидрофобных взаимодействий, объединяются между собой с помощью, главным образом, полярных взаимодействий, образуя «вторичные» структуры В пользу подобного «вторичного» связывания, в котором могут принимать участие углеводные цепи молекулы ЛПС, может свидетельствовать диссоциация агрегатов под действием мочевины и при повышении ионной силы раствора, а также уменьшение доступности полисахаридных детерминант с увеличением размеров агрегатов.

Сравнительный анализ физико-химических свойств ЛПБК и ЛПС показывает, что основные физические свойства ЛПБК определяются ЛПС составляющей, но белковый компонент вносит заметный вклад в его макромолекулярную организацию Об этом свидетельствуют выявленные различия между ЛПС и ЛПБК по размерам, морфологии агрегатов, их термотропному поведению и степени самоассоциации в растворе.

Физиологическая активность ЛПС и ЛПБК из Y. pseudotuberculosis

ЛПС и ЛПБК играют важную роль во взаимоотношениях бактериального патогена с организмом млекопитающих, оказывая влияние практически на все системы макроорганизма. Большая часть биологических эффектов ЛПС и ЛПБК связана с их высокой токсичностью и иммуногенностью. Как показали исследования, проведенные нами на экспериментальных животных, ЛПБК и ЛПС отличаются высокой токсичностью, сравнимой для обоих препаратов ЛД50

(летальная доза) для ЛГГБК и ЛПС составляет соответственно 131- 142 мкг/мышь и 125-158 мкг/мышь.

Известно, что эндотоксины грамотрицательных бактерий самостоятельно инициируют агрегационную активность тромбоцитов, которым принадлежит ведущая роль в каскаде гемокоагуляционных нарушений в условиях клинической и экспериментальной эндотоксинемии Изучение влияния эндотоксинов на тромбоциты крови выявило повреждающее действие как ЛПС, так и ЛПБК Однако, для ЛПБК это свойство проявлялось в меньшей степени Более того, при действии 50 мкг ЛПБК на тромбоциты крови донора было отмечено снижение суммарной степени агрегации при последовательном добавлении эндотоксина и АДФ - индуктора активации тромбоцитов.

Изучение динамики первичного гуморального ответа на введение ЛПБК и ЛПС показало, что ЛПБК обладает значительно большей иммуногенностью по сравнению с ЛПС.

Получены данные, свидетельствующие о том, что ЛПБК и ЛПС играют определенную роль в процессе фагоцитоза бактерий псевдотуберкулеза макрофагами, при этом ЛПБК усиливает поглотительную активность макрофагов в широком диапазоне концентраций, в то время как для ЛПС этот эффект проявляется только при его низкой концентрации.

Исследовано влияние молекулярной массы эндотоксинов на проявление ими ряда биологических свойств Установлено, что ЛПБК с разной, но достаточно высокой молекулярной массой (3,6 МДа и 1,2 МДа) обладают одинаковой иммуногенностью для кроликов, в то время как субъединица ЛПБК (0,12МДа) проявляет очень низкую иммуногенность Молекулярная масса агрегатов ЛПБК играет важную роль в проявлении токсичности В экспериментах на мышах (с предварительным введением галактозамина, усиливающего токсический эффект) ЛД50 для ЛПБК с мол массой 12 кДа составляет 2 мкг/мышь Уменьшение мол. массы ЛПБК на два порядка приводит к падению его токсичности в 4,5 раза.

Изучена способность ЛПС индуцировать синтез мононуклеарными клетками крови человека таких цитокинов, как фактор некроза опухоли (ФИО) и интерлейкин-6 (ИЛ-6) ЛПС были выдержаны при разных температурах (20°С и 37°С), и их молекулярные массы при этих температурах, как было показано выше, равны 2,3 МДа и 0,35 МДа соответственно (Табл. 5). Как показали результаты (Рис 8), инициирующая роль ЛПС в индукции клетками ФНО и ИЛ-6 незначительно увеличивается по мере уменьшения его молекулярной массы.

Антигенная активность ЛПБК и ЛПС зависит от их физико-химических свойств, что видно из анализа связывающей активности эндотоксинов (инкубированных в растворе при температуре в области 5°С-55°С) с О-полисахарид-специфическими антителами Связывающая активность ЛПБК и ЛПС, определенная с помощью РИА, существенно зависит от температуры растворения образцов, и графики этой зависимости имеют несколько точек перегиба в области 20 С-55°С (Рис 9). Различия в активности этих антигенов соответствуют изменениям гидродинамических характеристик и морфологии их агрегатов Уменьшение связывающей способности антигенов в диапазоне температур 10-30°С имеет место с увеличением молекулярной массы и асимметрии частиц (Табл 5 ) Влияние температуры на доступность детерминант в О-антигенах при их связывании с антителами, видимо, объясняется нарушением плотности упаковки или степени экранирования углеводных Цепей в агрегатах антигенов в связи с изменением их размера, формы или структурной организации. Важным фактором,

влияющим на связывающую активность модифицированных нагреванием О-антигенов, является конформация О-цепей, которая, как известно, изменяется при термотропных структурных переходах в агрегатах. Действие этого фактора особенно сильно проявляется в крайних точках рассматриваемого температурного интервала (5°С и 55°С).

Рис 8 Уровень синтеза ФНО-а Рис 9 Температурная зависимость

клетками крови человека под О-антигенной активности ЛПБК и ЛПС действием 1 - ЛПС, 37°С, 2 - ЛПС, 20°С. 3 - контроль (физ.р-р)

Таким образом, физико-химические характеристики ЛПС, а так же то, находится ли он в свободном состоянии или в комплексе с белком, играют важную роль в проявлении им физиологической активности Токсичность и иммуногенность эндотоксинов во многом определяются молекулярной массой их агрегатов.

Макромолекулярное строение агрегатов ЛПС и ЛПБК оказывает существенное влияние на их связывание с антителами и, как можно предположить, с иммуноглобулиновыми рецепторами на иммунокомпетентных клетках и с другими ЛПС-связывающими белками хозяина. Таким образом, активность эндотоксинов зависит от их физического состояния и может регулироваться различными факторами, влияющими на надмолекулярную организацию ЛПС К таким факторам могут относиться и вещества, взаимодействующие с ЛПС

Полисахариды: получение, структура, свойства

Как известно, ряд антибиотиков, используемых при лечении инфекционных заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, связываются с ЛПС, выделяемыми этими бактериями, и изменяют его макромолекулярную организацию Антибиотики часто обладают побочным эффектом В связи с этим актуален поиск веществ, сочетающих максимальную активность по нейтрализации токсического действия эндотоксина за счет связывания с ним, и в то же время, обладающих минимальным повреждающим эффектом на макроорганизм

Для этих целей выбраны полисахариды морского происхождения - хитозан и каррагинан, бактерицидная и иммуностимулирующая активности которых предполагают повышение неспецифической сопротивляемости организма

Для изучения взаимодействия биополимеров в растворах необходима характеристика взаимодействующих компонентов В связи с этим в данной работе

две главы посвящены получению, установлению структуры и изучению физико-химических характеристик полисахаридов, используемых с целью модификации физиологической активности ЛПС

Хитозан. Получение и свойства

Имеющиеся в литературе данные о физико-химических свойствах хитозана J получены для кислых растворов полимера, что обусловлено его хорошей

растворимостью при низких значениях рН В связи с задачами, поставленными в данной работе, необходимо было изучить поведение хитозана в водных средах при рН, близких к нейтральным « В работе использован хитозан различной степени полимеризации в виде

двух образцов, полученных последовательной деполимеризацией хитина. Согласно данным ИК- и |3С- ЯМР спектроскопии исследуемые полисахариды представляют собой полимеры (3- 1,4 О-глюкозамина, в которых содержание Ы-ацетильных групп составляет 4%. Хитозаны были обозначены как Х-НМ и Х-ВМ и их молекулярные массы, определенные методом аналитического центрифугирования, равны 30 кДа и 130кДа соответственно. Была определена вязкость растворов хитозанов при 25°С и 37°С в двух растворителях - растворе 0,01 М фосфатного буфера/0,15 М №С1, (рН=6) и в растворе 0,1МАсОН/0,2М №С1 Физико-химические характеристики хитозанов приведены в Табл 6

Таблица 6 Физико-химические характеристики хитозанов (0,01 М фосфатный буфер /0,15 М №С1, рН 6)

Вещество Т°,С 1 Г| |,мл/г в-10 13 М, кДа ОТо

Х-ВМ 25 160,0 94,0* 1,50 130 123* 8,1

37 120,0 1,51 8,1

Х-НМ 25 5,0 18,0* 1,23 30 20* 3,7

37 5,3 28,0

♦значения получены для раствора хитозана в 0,1 МАсОН/0,2М №С1

Как видно из таблицы 6, вязкость растворов хитозанов изменяется с изменением рН среды, особенно в случае Х-НМ.

Большие значения рассчитанные для образцов хитозана, указывают на высокую степень асимметрии молекул полимеров, особенно в случае Х-ВМ. Различие в гидродинамических характеристиках Х-ВМ и Х-НМ, вероятно, связано с различной конформацией их молекул в растворе Значения параметра а, рассчитанные из уравнения Марка-Хаувинка-Куна, позволяют предположить, что в водных растворах, близким к нейтральным (рН 6), Х-НМ представляют собой гибкие линейные макромолекулы (а= 0,7), а Х-ВМ образуют жесткие структуры (а=0,96) С увеличением температуры от 25°С до 37°С наблюдается значительный рост коэффициента седиментации Х-НМ, в то время как значение характеристической вязкости остается практически неизменным, что, вероятно, связано с изменением конформации молекул Х-НМ, которая при повышенной температуре может соответствовать форме свободно-протскаемого клубка Физико-химические характеристики Х-ВМ практически остаются неизменными

при повышении температуры, чему, вероятно, может способствовать склонность высокомолекулярных образцов полисахарида к образованию межмолекулярных ассоциатов Данные, полученные гидродинамическими методами, согласуются с результатами электронно-микроскопического исследования Под электронным микроскопом в случае Х-ВМ наблюдаются длинные нити, соединенные между собой, в то время как молекулы Х-НМ имеют форму коротких стержней

Таким образом, изучение двух образцов хитозана с молекулярной массой 130 и 30 кДа в растворах, близким к нейтральным (рН 6), позволило выявить существенные различия в конформации двух образцов полисахарида, что может отражаться при взаимодействии этого поликатиона с ЛПС

Структура и свойства каррагинанов из водорослей Лскосагрия сггпИж, Скоплю ртпиШю, С1юпг1ги$ агтаШя

Физико-химические и биологические свойства каррагинанов в значительной степени определяются их структурой, характеризуемой большим разнообразием В основе структуры каррагинанов лежит дисахаридное звено, состоящее из остатков О-галактозы и ее производных, соединенных регулярно чередующимися р-1-4 и а -13 гликозидными связями. Структура каррагинанов зависит от вида водоросли, места ее обитания и фазы вегетации Последнее особенно важно, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий в себя чередование вегетативного, полового и бесполого размножения.

В работе использованы каррагинаны, выделенные из наиболее распространенных в дальневосточных морях красных водорослей, представителей семейств О^агипасеае (ОгопАгиз ртпи1аш и С. агтаШ) и ТюИосаграсеае (Т/сйосягрм^ сг1пии$), собранных в соответствии с их стадией развития -вегетативной и репродуктивной.

Исследуемые полисахариды были выделены из водорослей экстракцией водой (90°С) и фракционированы осаждением 4% КС1 на желирующие (КС1-нерастворимые) и нежелирующие (КС1-растворимые) фракции, выход и характеристики которых представлены в Табл 7 Основными моносахаридами всех фракций являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза. Согласно химической структуре желирующих типов каррагинана, построенных из повторяющихся дисахаридных звеньев этих моносахаридов, их соотношение в случае регулярности полимерной цепи должно быть равным 1 Как видно из таблицы 7, такая регулярность, в основном, наблюдается для полисахаридов из вегетативной формы водоросли.

Для идентификации полисахаридов и отнесения их к определенному типу каррагинана использовали методы 13С-ЯМР- и ИК-Фурье спектроскопии, сопоставляя все полученные спектры полисахаридов со спектрами каррагинанов известных предельных структур.

В ИК-спектрах полисахаридов желирующего типа из двух форм водоросли Т. сптш наблюдается интенсивная полоса поглощения при 932 см' , характерная для 3,6-ангидрогалактозы и полоса поглощения при 847 см"1, относящаяся к сульфатной группе при С-4 остатка 3,6-ангидрогалактозы, что позволяет отнести эти полисахариды к к-типу каррагинана Полоса слабой интенсивности в области 893 см"1 указывает на присутствие несульфатированного остатка галактозы, что характерно как для 0-, так и а-типов каррагинанов Отсутствие полосы поглощения

при 805 см'1, характерной для сульфатной группы при С-2 остатка 3,6-ангидро-Г)-галактозы а-каррагинана, говорит в пользу р-типа этого полисахарида (Рис 10)

Таблица 7 Выход и химический анализ полисахаридных фракций, выделенных из двух форм водорослей Т сгШшя, С р1ппи1ши$,.С агтМия

Вид водоросли Форма водоросли фракции полисахаридов Выход (%) на в.м Содержание (%) от сухого вещества AnGal/ Gal моль/ моль

Gal 3,6-AnGal so42 белок

Т crinitus Вегетативная А В 16,0 5,0 33,1 37,7 30,0 5,6 20,0 27,0 5,2 10,5 1.0 :1 1 1 0 • 6.0

Репродуктивная- А В 30,0 7,0 39,0 33,2 25,5 7,2 15,0 26,8 7,0 7,8 1 0: 1.4 1.0: 4 0

C.pin-nulatus Вегетативная А В 40,0 9,4 32,9 36,5 29,9 23,9 24,9 2,8 3.1 1 0: 1.1

Репродуктивная А В 20,5 18,2 40,8 35,5 38,0 22,9 27,0 4,7 5,7 1.0 1 1

C.ar-matus Вегетативная А В 30 10 32,2 39,1 32,0 2,0 18,0 26,0 1,9 2,1 1.0: 1.0

А - KCl-нерастворимая фракция полисахаридов В - KCl-растворимая фракция полисахаридов

Анализ 13С-ЯМР спектров этих полисахаридов подтверждает данные ИК-спектроскопии В 13С-ЯМР спектрах полисахаридов желирующих фракций из репродуктивной и вегетативной форм водоросли в области резонанса аномерных углеродных атомов наблюдаются четыре сигнала. Сигналы с 5 95.3 м.д. относятся к атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-0-галактозы Р-типа каррагинана, а сигналы с 8 95.8 м.д. (Рис. 11) соответствуют атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-0-галактозы к-каррагинана Плохо разрешенные сигналы двойной интегральной интенсивности с химическими сдвигами б 103 2 м.д. и 103.3 м д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 остатков галактозы к- и р-типов каррагинанов. Спектры 13С-ЯМР полисахаридов в области относительно сильного поля также имеют типичный для к- и р-типов каррагинанов вид, но отличаются между собой соотношением дисахаридных к- и р-звеньев, что следует из интенсивности соответствующих сигналов в 13С-ЯМР-спекграх В каррагинане из вегетативной формы водоросли преобладают дисахаридные звенья к-типа (80%), тогда как в полисахариде из репродуктивной формы их содержание примерно одинаково (3 2) Кроме того, последние содержат в небольшом количестве сульфатированные дисахаридные звенья, соответствующие предшественникам к-типа каррагинанов

Рис 10. ИК-спектры желирующих полисахаридов, выделенных из вегетативной (а, а') и репродуктивной (б, б') форм Т crinitus

13С ЯМР - спектры полисахаридов нежелирующих фракций из двух форм водоросли идентичны, но сложны для интерпретации Для улучшения разрешения спектров эти полисахариды были обработаны NaOH Спектры полученных продуктов содержат 12 сигналов, однако, при сравнении их со спектрами известных структур каррагинанов отнести полисахариды к определенному типу не удалось. Анализ спектров ПМР с использованием 2D экспериментов COSY, TOCSY, ROESY, позволил провести отнесение сигналов протонов моносахаридных остатков, а использование HSQC эксперимента позволило провести С/Н корреляцию. На основании полученных и литературных данных сделан предположительный вывод, что в основе нежелирующих полисахаридов лежит повторяющееся дисахаридное звено, состоящее из p-l,3-D-галактопиранозил-2,4,-дисульфата и а-1,4-(3,6-ангидро)-0-галактопиранозида Этот полисахарид был обозначен как каррагинан Х-типа

По данным 13С ЯМР- и ИК- спектроскопии с Фурье-преобразованием полисахариды желирующих фракций из вегетативной и репродуктивной форм С pinnulalus имеют идентичную структуру, относящуюся к кЛ-каррагинанам. 13С-ЯМР спектры этих полисахаридов содержат более 12 сигналов, что в целом говорит об их нерегулярной структуре В области резонанса аномерных сигналов наблюдаются 4 различных сигнала Двойные сигналы с 8 95 9 м.д относятся к С1-атомам остатков 3,6-ангидро-0-галактозы к-каррагинана, а сигналы с 8 92 7 м.д. соответствуют С1-атомам остатков 3,6-ангидро-0-галактозы i-каррагинана Двойные сигналы с химическими сдвигами 103.2 и 103 1 м.д. относятся к атомам С1-остатков галактозы к- и i-типов каррагинанов. В ИК-спектрах желирующих типов полисахаридов из С. pinnulatus наблюдается интенсивная полоса поглощения при 930 см"', характерная для 3,6-ангидрогалактозы и полоса поглощения при 848 смотносящаяся к сульфатной группе при С4-остатка галактозы, что позволяет отнести полисахариды к к-каррагинанам. Полоса поглощения в области 804 см"1 указывает на присутствие сульфатной группы при С2-остатка 3,6-ангидрогалактозы, что является характерным для i-каррагинана Таким образом, данные ИК-спектроскопии также указывают на то, что исследуемые полисахариды относятся к к/i- каррагинанам Разложение ИК-спектров на индивидуальные компоненты (рис.12) позволило оценить содержание к- и i-звеньев в исследуемых

каррагинанах. Расчеты, сделанные на основании соотношения площадей полос поглощения при 848 и 806 см"1, характерных для 1-каррагинана, показали, что в каррагинане из вегетативной формы водоросли содержание 1-звеньев меньше, чем из репродуктивной. Различие в соотношении дисахаридных звеньев к- и 1-типов следует также из отношения интенсивности сигналов в 13С-ЯМР-спектрах. Для полисахаридов, выделенных из вегетативной формы водоросли, это соотношение составляет 3:2, а из репродуктивной -41.

1-1-1-1-1-1-1-1-г

105 100 95 90 85 80 75 70 55

Рис. И. "С-ЯМР -спектр КС1-нерастворимой фракции полисахаридов из вегетативной формы Т. спмш.

Анализ результатов, полученных методом ИК-спектроскопии, позволяет предположить, что нежелирующие полисахариды из С. ртпиШих являются смесью Х-типа с другими типами каррагинанов, имеющими низкое содержание 3,6-ангидрогалактозы.

Таким образом, согласно данным ЯМР- и ИК-спектроскопии желирующие полисахариды из вегетативной и репродуктивной форм Т. сптш и С. р'тпи1аш имеют структуры каррагинанов, относящихся к к/р- и кЛ-типам соответственно

Желирующие полисахариды из водорослей С. агташ, собранных в вегетативной фазе роста, по данным ИК- и ЯМР-спектроскопии имеют более простую структуру, относящуюся к к-каррагинанам. ИК-спектр КС 1-растворимых полисахаридов из С. агтагш идентичен спектрам коммерческого Х-каррагинана

(фирмы «Sigma») и характерная полоса поглощения в области 824см"' указывает на то, что исследуемые полисахариды относятся в основном к Х-типу каррагинанов

Рис. 12. Разложение ИК-спектра КС1-нерастворимых фракций полисахаридов из вегетативной формы С. ртпиЫия на индивидуальные компоненты.

Таблица 8 Физико-химические характеристики каррагинанов из водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae

Водоросль Структур- Вегетативная ф-ма Репродуктивная ф-ма

ный тип [Л], мл/г М, кДа [т]], мл/г М, кДа

С К/1 0,48 х 10 ' 294 0,28 х 103 160

pinnulatus X 0,39 х 103 237 0,63 х 103 390

Т. crinitus к/р 0,62 х Ш3 380 0,34 х 103 202

Х-тип 0,36 х 103 214 0,46 х 103 250

C.armatus к н/о 312

X н/о 246

Все параметры получены для растворов каррагинанов в 0,М NaCl.

Согласно результатам, полученным методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Asipark CS-620, все исследуемые полисахариды полидисперсны по молекулярным массам, значения которых находятся в пределах 200-500 кДа По данным аналитического центрифугирования и вискозиметрии наибольшую средневесовую молекулярную массу имеет к/р-каррагинан из вегетативной формы Т. crinitus (Табл.8)

При исследовании реологических свойств полисахаридов было обнаружено, что наилучшие желирующие свойства проявляют к/1-каррагинаны из репродуктивной формы С pinnulatus, формирующие гели высокой прочности Анализ спектров динамической вязкости (при низкой скорости сдвига) нежелирующих типов каррагинанов показал, что полисахариды из С. pinnulatus имеют в концентрированных растворах конформацию неупорядоченного клубка ("random coil") в диапазоне температур от 20- до 65° С, в то время как для каррагинанов из Т. crinitus подобная конформация характерна только при высоких температурах.

Взаимодействие ЛПС с хитозаном

Так как известно, что токсическим центром ЛПС является липид А -анионная и амфифильная часть молекулы, то катионные амфифилы могут представлять потенциальные идеальные лиганды для детоксикации ЛПС. В качестве специфического лиганда ЛПС нами выбран полиамин - хитозан. Этот выбор продиктован двумя обстоятельствами. Во-первых, поликатионная природа хитозана предполагает его способность связываться с ЛПС и, возможно, нейтрализовать его токсическое действие, что открывает перспективы использования этого полиамина в терапии грамотрицателыюй инфекции Во-вторых, комплексы ЛПС-хитозан могут служить удобной моделью для изучения взаимодействия бактериальных ЛПС с белками поликатионной природы млекопитающих и могут внести определенный вклад в понимание механизма биологического действия ЛПС.

Как было показано выше, надмолекулярная организация агрегатов ЛПС и ЛПБК зависит от структуры эндотоксина и его концентрации, а также времени растворения ЛПС, температуры и ионной силы раствора Следует предположить, что эти параметры могут играть существенную роль при взаимодействии ЛПС с поликатионами и, в частности, с хитозаном.

Для изучения взаимодействия эндотоксинов с хитозаном использованы несколько образцов ЛПС, которые были очищены, как описано выше ЛПС-I и ЛПС-П, выделенные из микробной массы У. pseudotuberculosis (серовар 1В, 598 штамм) по методу Вестфаля и Галаноса имеют среднюю степень полимеризации пентасахаридных О-специфических цепей 13 и 2, и степень ацилирования остатков 3-гидрокситетрадекановой кислоты - 27% и 45% соответственно. Кроме того, в работе был использован ЛПС из Escherichia coli 055:В5 (Sigma,USA).

Исследование взаимодействия ЛПС с хитозанами проводили методами аналитического и препаративного центрифугирования, оптической и флуоресцентной спектроскопии, электронной микроскопии, а также компьютерного моделирования.

Как показали результаты, важным фактором, влияющим на связывание ЛПС с хитозаном, является температура. При смешивании исходных ЛПС и хитозана при 25°С и центрифугировании их смеси в градиенте плотности глицерина или перколла образование комплекса не обнаружено

Aj40 А ,475 А475,540

2 4 в в 10 12

Номера фракц ий

L

Номера фраюии

10 12 14 1в

"А

8 10 12 14 16

t-Ьмера фракдой

Рис 13. Скоростная седиментация в градиенте глицерина ЛПС-1 -(а), Х-НМ-(б) и их смеси ЛПС/Х-НМ 1:5 (в/в) -(с). Исходные компоненты инкубированы при 37°С в течение 48 ч, смесь ЛПС хитозан выдержана при 37°С в течение 18 ч Содержание ЫНг-групп (А475) (1); ЛПС/КДО (А540) (2).

Результаты скоростной седиментации в градиенте глицерина показали, что только предварительная инкубация при 37°С ЛПС и хитозана, а также последующая инкубация их смеси при 37°С приводит к связыванию ЛПС с хитозаном и образованию комплекса Доказательством образования комплекса между ЛПС и Х-НМ при предварительном выдерживании каждого компонента, а затем их смеси при 37°, является совпадение максимумов кривых распределения хитозана и ЛПС в зоне одной плотности глицерина при центрифугировании (Рис 13с).

Подтверждением образования комплекса между ЛПС и хитозаном являются данные аналитического центрифугирования. Как видно из рис. 14, наличие единственной границы седиментации характерно как для исходных компонентов, так и их смесей в диапазоне весовых соотношений ЛПС-хитозан от 1:1 до 1:5. При содержании в смеси хитозана, в 7 раз превышающем количество ЛПС (ЛПС.Х = 1:7 в/в), на седиментограмме появляется второй пик, с коэффициентом седиментации, характерным для исходного хитозана. Полное насыщение ЛПС хитозаном происходит при концентрации последнего, превышающего концентрацию ЛПС из У. р$ес1ошЬегси1о$15 в 5 раз, а ЛПС из Е.соИ в 7 раз (при исходной концентрации ЛПС 1мг/мл).

"X

ЛПС

=ол -

А

S=2.2

А

А

XX

Рис. 14. Седиментограмма ЛПС из У pseudotuberculosis -а; Х-НМ - б; их смесей при соотношении ЛПС/Х-НМ 1:1 - в; 1: 5 - г;. 1:7 - д. По оси X -расстояние от оси вращения (г) и Y- градиент концентрации dc/dx.

Результаты электронно-микроскопического исследования взаимодействия ЛПС с хитозаном полностью согласуются с данными, полученными методами седиментации Добавление хитозана к раствору ЛПС при 20°С практически не изменяет ультраструктуру эндотоксина, тогда как предварительная инкубации ЛПС и его смеси с Х-НМ при 37°С свидетельствует о существенном влиянии поликатиона на морфологию ЛПС (Рис.15в, г), что проявляется в отсутствии крупных ассоциатов и лентоподобных образований, характерных для исходного ЛПС (Рис. 15 а).

Таким образом, ЛПС взаимодействует с хитозаном с образованием комплексов различной стехиометрии. Связывание ЛПС с хитозаном представляет собой сложный процесс, который является время - и температурозависимым. Существенное влияние температурного фактора на взаимодействие ЛПС с хитозаном отражает важную роль в этом процессе макромолекулярной структуры ЛПС Вероятно, в крупных и асимметричных агрегатах ЛПС с молекулярной массой порядка 6 МДа, образующихся в растворе при температуре свыше 20°С, участки связывания на его макромолекулах недоступны для хитозана. Изменение агрегатного состояния, приводящее к 20-кратному уменьшению молекулярной массы ЛПС и обусловленное его термотропными переходами, которые, как показано выше, наблюдаются в данном температурном интервале 5 - 45°С и, вероятно, вызваны изменениями в конформации полисахаридных цепей и углеводородных цепей жирных кислот липидного фрагмента ЛПС, способствует связыванию эндотоксина с хитозаном.

КТГЖ эвшми*

• ^ .«ч г

ХМ

Рис 15 Электронная микрофотография' ЛПС Y pseudotuberculosis - а, Х-НМ - б; комплекс ЛПС -Х-НМ (11 в/в, С= 1 мкг/мл) - в; комплекс ЛПС - Х-НМ (Мв/в, С = 250мкг/мл ) - г Окрашивание 2% ФВК Масштаб 1см= ЮОнм

Комплексообразование хитозана с ЛПС сопровождается дальнейшей диссоциацией последнего. Дезагрегация ЛПС, наблюдаемая в процессе его связывания с хитозаном, подтверждается результатами оптической спектроскопии и аналитического ультрацентрифугирования Молекулярная масса комплекса ЛПС-Х-НМ, по данным метода Арчибальда, составляет 160 кДа, в то время как молекулярная масса ЛПС, выдержанного при 37°С, равна 300 кДа

Взаимодействие ЛПС с хитозаном приводит к образованию комплексов различной стехиометрии от 11 до 15 в случае ЛПС из Y pseudotuberculosis и 11 до 1 7 для ЛПС из Е coll Эти комплексы получены при высокой концентрации ЛПС (выше 1 мг/мл) и характеризуются его низким содержанием (как следует из расчетов, на 1 моль ЛПС приходится свыше 200 остатков D-глюкозамина в хитозане для комплекса ЛПС-ХН 1 р5в/в).

Метод флуоресценции, позволивший изучить комплексообразование в области низких концентраций полимеров, показал, что кажущаяся стехиометрия комплексов ЛПС-хитозан, рассчитанная в точке насыщения, не является постоянной величиной, а зависит от концентрации взаимодействующих компонентов в растворе Как показали расчеты, в комплексах ЛПС-хитозан, полученных при концентрации хитозана 20, 50 и 100 мю/мл, 1 моль ЛПС приходится на каждые 14, 17 и 22 остатка D-глюкозамина в молекуле хитозана Таким образом, чем меньше концентрация ЛПС, тем больше ею связывается с хитозаном при образовании комплекса. Электронно-микроскопическое изучение

препаратов ЛПС и их комплексов с хитозаном подтверждает влияние концентрации полимеров на структуру изучаемых комплексов. При низких концентрациях взаимодействующих компонентов (250 мкг/мл) полученные комплексы выглядят как морфологически однородные сферические частицы с диаметром 7-12 нм (Рис 15 г). С увеличением концентрации до 1 мг/мл наблюдается образование комплексов различной морфологии- сферических частиц, тонких нитей (Рис. 15в). Такая зависимость стехиометрии комплексов от концентрации определяется, видимо, агрегатным состоянием ЛПС, которое, как было показано выше, зависит от концентрации его в растворе.

Методом компьютерного моделирования проведена количественная оценка взаимодействия ЛПС с хитозаном. Для этих целей был использован полуэмпирический квантово-химический метод АМ, позволяющий оптимизировать молекулярные конфигурации и находить энергию взаимодействия Как показали расчеты, комплекс, образующийся при связывании хитозана с ЛПС, характеризуется равновесным расстоянием, равным 0.17 нм, между взаимодействующими центрами и энергией связи 0 5 эВ. Среди трех анионных связующих центров на молекуле ЛПС (карбоксильная группа на остатке КДО- и фосфатные группы на невосстанавливающем и восстанавливающем концах липида А) два оказались слабо активными. Расчетные данные указывают на то, что наиболее вероятным является участие в связывании только одного фосфата, находящегося в первом положении глюкозамина, в то время как взаимодействие на двух других отрицательно заряженных группах энергетически не выгодно. Результаты, полученные нами методом коллоидного титрования, согласуются с этим предположением.

Так как взаимодействие между ЛПС и хитозаном происходит при участии заряженных групп, то значение рН среды, определяющее степень ионизации этих групп, оказывает существенное влияние на процесс комплексообразования. Было установлено, что комплексы образуются в интервале рН от 4 0 до 7 0 и сохраняют стабильность в диапазоне ионной силы раствора от 0.2 до 1М 1МаС1.

Данные изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности СэС1, приведенные на Рис 16; показывают, что в условиях высокой ионной силы комплекс ЛПС-хитозан (с плотностью 1,41 г/см3) сохраняется.

Л

Плотность С$С1 I 4 ? г/си' Г/см}

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Номера фракции

(УетгностьСЕО Д

V

Плотность С®С1

г/см5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Номера фракции

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Нэмера

а в с

Рис 16. Изоплотностное центрифугирование в градиенте СзС1 а - Х-НМ, б-ЛПС-1, в- ЛПС-1/Х-НМ (1 5 в/в). Содержание М12-групп (А475) 0), ЛПС/КДО (А540) (2)

Устойчивость комплекса в условиях высокой ионной силы позволяет предполагать, что в его образовании наряду с электростатическим взаимодействием, принимают участие водородные связи Действительно,

результаты влияния мочевины как на процесс формирования комплексов ЛПС с X-ВМ, так и на их стабильность подтвердили это предположение

Полученные данные позволяют предположить, что на молекуле ЛПС имеется несколько участков связывания с хитозаном Одна группа мест связывания локализована преимущественно в области кор-липид А и отвечает за ионные взаимодействия, а на других участках взаимодействие осуществляется за счет водородных связей.

С целью изучения механизма взаимодействия между ЛПС и хитозаном было исследовано влияние структуры ЛПС и молекулярной массы хитозана на процесс образования комплексов Определение параметров связывания ЛПС с хитозанами проводили в 0,005М фосфатном буфере (рН 5,0), используя ЛПС со степенью полимеризации О-специфического полисахарида 24 (ЛПС -III), и ЛПС, лишенный О-специфических цепей (R-ЛПС), наряду с уже описанными образцами ЛПС-I и ЛПС-Н из У pseudotuberculosis (серовар 1В, 598 штамм). Для определения констант связывания ЛПС с Х-НМ и Х-ВМ был использован метод конкурентного связывания эндотоксина с комплексом хитозан/анионный краситель - тропеолин ООО- натриевая соль-2 [4-(2-гидрокси-1-нафто-)бензолсульфокислоты] Метод основан на вытеснении красителя из его комплекса с хитозаном с помощью ЛПС с последующей регистрацией высвободившегося тропеолина

С помощью графиков Скэтчарда и Хилла были определены константы связывания хитозанов с ЛПС, значения которых представлены в Табл. 9.

am

Ц05-

Of»

- 0,05'

ao

02 AD

<М

0,00'

ОДв

aot

ОДЫ

-4- 3 • A 4

QO

4D

Рис 17 Графики Скэтчарда для связывания ЛПС с хитозанами Х-НМ (а), где 1 -Я-Л ПС; 2 - ЛПС-1; 3 - ЛПС-П; 4 - ЛПС-Ш; Х-ВМ (б), где 1 - К-ЛПС, 2 - ЛПС-1; Х-ВМ (в), где 3 - ЛПС-11, 4 - ЛПС-3 Комплекс хитозан-тропеолин титровали раствором ЛПС Поглощение определяли при длине волны 483 нм С-концентрация внесенного ЛПС, ЛЭ-разница оптического поглощения раствора хитозан-тропеолина до и после внесения ЛПС

Из кривых насыщения была определена концентрация ЛПС, соответствующая точке насыщения хитозана эндотоксином, и на основании этого было рассчитано число мест связывания в точке насыщения Как показал анализ графиков Скэтчарда, на процесс формирования комплекса влияет как структура ЛПС, так и молекулярная масса хитозана Линейный график Скэтчарда (Рис 17а) «' представляющий данные по связыванию ЛПС с Х-НМ и комплексов Х-ВМ с Я-

ЛПС и ЛПС-1 (Рис 176) предполагает отсутствие кооперативности в процессе взаимодействия и то, что в этом процессе участвует один тип мест связывания Значения коэффициентов кооперативности, определенные из графика Хилла, близки к единице, что согласуется с этим предположением (Табл 9) В то же время для системы Х-ВМ и ЛПС с длинной О-специфической цепью (ЛПС-1 и ЛПС-Ш) график Скэтчарда (Рис. 17в) имеет вид вогнутой кривой, что может быть

следствием как наличия двух типов мест связывания (высоко- и низкоаффинных), так и отрицательной кооперативное™

Наличие двух независимых участков связывания на молекуле хитозана представляется маловероятным, поскольку поликатион содержит только аминогруппы с преимущественно одинаковым окружением. Поливалентность лиганда (ЛПС), предполагающая, что две константы связывания могут соответствовать взаимодействиям неэквивалентных отрицательно заряженных групп ЛПС с хитозаном, также не представляется состоятельной, поскольку во всех ЛПС, используемых в эксперименте, число и природа таких групп, которые потенциально могут связываться с поликатионом, одинакова, и наблюдаемые различия в форме кривых не могут быть объяснены в рамках вышеназванной модели Кроме того, полученные нами данные компьютерного моделирования взаимодействия ЛПС-хитозан показали, что наиболее вероятно связывание только с одним фосфатом в первом положении глюкозамина, в то время как взаимодействие с другими отрицательно заряженными группами энергетически невыгодно Таким образом, вогнутый характер графиков Скэтчарда для связывания ЛПС-П и ЛПС-Ш с Х-ВМ может быть результатом антикооперативного взаимодействия При оценке числа мест связывания на ЛПС, наблюдается следующая закономерность с увеличением длины О-цепи уменьшается количество мест связывания на эндотоксине в расчете на мопомерное звено хитозана Этот факт можно объяснить тем, что длинные О-цепи, с одной стороны, могут частично экранировать участки на молекуле ЛПС, которые отвечают за связывание (отрицательно заряженные группы кора и липида А), а с другой стороны, могут создавать пространственные затруднения при связывании дигандов на соседних сайтах

Выявленные зависимости Ка[с и стехиометрии комплексов от размера О-цепи ЛПС справедливы для обоих образцов хитозана. Однако ВМ-Х связывает в точке насыщения меньше ЛПС в расчете на мономерное звено и с меньшей аффинностью, чем НМ-Х Наблюдаемое различие в способности двух хитозанов связываться с ЛПС, по-видимому, обусловлено не только разной степенью полимеризации поликатионов, но и различиями в конформации их молекул.

Таблица 9 Параметры связывания ЛПС с хитозанами

Комплекс Кс 105 кс ю5 кс 105 И коэф- Число моль

моль/л моль/л моль/л фициент ЛПС на 1

(Скэтчард (Хилл) (среднее Хилла ЫН2-фупиу

значение хитозана

Х-НМ

Я-ЛПС 0,759 0,791 0,775 1,020 0,26

ЛПС-1 1,015 1,009 1,012 1,000 0,19

ЛПС-П 1,840 1,753 1,797 0,9748 0,11

ЛПС-Ш 5,930 6,015 5,973 1,016 0,04

Х-ВМ

Я-ЛПС 0,331 0,326 0,329 1,000 0,17

ЛПС-1 0,617 0,594 0,606 0,997 0,13

ЛПС-П - 0,504 - 0,929 0,09

ЛПС-Ш - 2,820 - 0,974 0,05

Порядок констант связывания (105 моль1) согласуется со значениями этих параметров, приводимыми другими авторами для комплексов ЛПС с полимерами катионной природы.

Таким образом, ЛПС взаимодействует с хитозаном с образованием стабильных комплексов различной стехиометрии Процесс связывания отражает общий принцип взаимодействия эндотоксинов с поликатионами и зависит от таких факторов, как температура, рН и ионная сила раствора, структура ЛПС и степень полимеризации хитозана Макромолекулярная структура ЛПС играет важную роль в процессе взаимодействия.

Сравнительная характеристика физиологической активности ЛПС и его комплекса с хитозаном

Как было показано выше, взаимодействие ЛПС с хитозаном прежде всего, осуществляется через область липида А, который ответственен за многие биологические свойства эндотоксина, включая токсичность, в связи с чем следовало ожидать изменение различных видов активности ЛПС.

Сравнительное изучение токсичности комплексов ЛПС-хитозан различного состава (1:5, 1.1, 5:1 в/в) показало, что токсичность падает с уменьшением отношения ЛПС хитозан, и самой низкой токсичностью обладает комплекс cociaea 1.5 (в/в) В таблице 10 приведена острая токсичность ЛПС их комплексов с Х-НМ и Х-ВМ (15 в/в), определенная на мышах линии BALB, в присутствии галактозамина и актиномицина, которые, как известно, увеличивают токсичность ЛПС и используются в экспериментах in vivo Как видно из данных (Табл.10), токсичность ЛПС из Y pseudotuberculosis и Е сок в комплексе с хитозаном снижается с галактозамином в 7,5 и 5 раз, а с актиномицином - в 5,5 и 12,5 соответственно

Таблица 10. Токсичность ЛПС и его комплексов с хитозанами 1.5 (в/в)

Вещество LD50(MKr на 1 мышь) при введении с галактозамином LD50 (мкг на 1 мышь) при введении с актиномицином D

ЛПС Y pseudotuberculosis 0,059 0,28

ЛПС Y pseudotuberculosis -Х-ВМ (1-5 в/в) 0,447 -

ЛПС Y pseudotuberculosis -Х-НМ (1-5 в/в) - 1,50

ЛПСЕ colt 0,034 0,20

ЛПС Е сок - Х-ВМ (1 5 (в/в) 0,170 -

ЛПС Е coll - Х-НМ (1 5 в/в) - 2,50

Известно, что ЛПС, являясь иммуностимуляторами, запускают процесс синтеза клетками иммунной системы различных цитокинов, включая ФИО и интерлейкины Была изучена способноыь ЛПС в составе комплексов с хитснамом вызывать индукцию ИЛ-8 и ФНО клетками иммунной системы человека ЛПС в комплексе с хитозаном не потерял способности индуцировать продукцию ИЛ-8 и ФНО in vitro Однако в результате комплсксообразовапия активность ЛПС из Е coli в отношении синтеза ФНО снижается более чем в 2 раза (Рис 18а) ЛПС как

из Y pseudotuberculosis, так и из Е coli при взаимодействии с хитозаном частично теряет способность к синтезу ИЛ-8 на 20% и 70% соответственно (Рис. 18 в)

Для изучения механизма изменения цитокин-индуцирующей активности ЛПС под действием хитозана были проведены эксперименты с использованием трансфицированных эмбриональных клеток почек человека (НЕК 293), содержащих TLR4 рецепторы, через взаимодействие с которыми ЛПС активирует синтез цитокинов.

с„„с = 10 мкг/мл С> |( = 50мкг/мл С „„ =05 мкг/мл С. = 2,5мкг/мл

ч

а

^

с

250л 200150100-

50-

1

I 10 100 10 Концешрация ЛПС, нг/мл ■ лпс, ¡НИ лпох-Bivt щз лхух+м

Рис 18. Влияние ЛПС Е coli (1), хитозана Х-НМ (2) и их комплексов ЛПС/Х-НМ 1 5 (3) на способность индуцировать клетками- а - ФНО, в -ИЛ-8

Рис. 19. Индукция ИЛ-8 НЕК 293 клетками, трансфицированными TLR4/MD2, под действием ЛПС из Е coli и его комплексов с хитозанами (1.5 в/в)

Как показали результаты, ни Х-ВМ, ни Х-НМ не способны активировать синтез ИЛ-8 дикими НЕК 293 клетками или НЕК 293 клетками, трансфицированными с ТЬК4/М02, и ни один из образцов хитозана не стимулирует активацию синтеза ИЛ-8 через ТЬЯЗ в НЕК 293 клетках Сравнительный анализ сигнальной индукции через ТЬЯ4 в НЕК 293 клетках под действием ЛПС и комплексов ЛПС-Х-НМ и ЛПС-Х-ВМ ( 1.5 в/в) показал, что комплекс ЛПС-Х-ВМ очень слабо стимулирует индукцию ИЛ-8 этими клетками, а комплекс ЛПС-Х-НМ стимулирует синтез эгого интерлейкина подобно чистому ЛПС (Рис. 19). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что хитозан индуцируе! синтез циюкинов независимо от Т1Л и не блокирует Т1_Я4 рецептор для связывания с ЛПС и ЛПС - сигнальной индукции в клетках. Таким образом, уменьшение способности ЛПС в составе комплекса индуцировать синтез цитокинов не связано с ингибированием хигозаном взаимодействия ЛПС с То11-1лке рецепторами.

Изучена модификация иммунобиологических свойств ЛПС при образовании им комплекса с хитозаном В комплексе с хитозаном ЛПС сохраняет иммуностимулирующее действие, при этом в сравнении со свободным ЛПС,

комплекс более эффективно стимулирует фагоцитарные функции макрофагов, увеличивая их способность к поглощению бактерий псевдотуберкулеза ЛПС, связанный с хитозаном, теряет способность частично подавлять реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ).

Возможность ослабления повреждающего действия ЛПС на клетки крови при комплсксообразовании с хитозаном была изучена при определении афегациошгой способности тромбоцитов здорового человека под действием различных доз ЛПС из Е cok, X-IIM и комплекса ЛПС - Х-НМ Полученные результаты показали, что хитозан является протектором клеток от такого сильного индуктора агрегации тромбоцитов, как АДФ Инкубация тромбоцитов в течение 5 мин с комплексом ЛПС-Х-НМ (1'5 в/в) в концентрациях 16 и 160 мкг/мл приводит к достоверному снижению степени агре!ации на 5% и 8%, соответственно, по сравнению с контролем и на 14% и 11% - по сравнению с суммарной степенью агрегации, вызванной ЛПС и АДФ

Каррагинаны - ингибиторы токсического действия ЛПС

Известно, что ЛПС бактерий определяют функциональную активность иммунной системы всего организма в целом, а гиперреакция иммунной системы на компоненты бактериальной стенки, в том числе ЛПС, лежит в основе многих воспалительных заболеваний кишечника Общепризнано, что эффективность иммунитета в какой-то мере зависит от особенностей питания, а пищевые волокна, к которым относится и каррагинан, усиливают процессы иммунной защиты Особая роль каррагинанов состоит в том, что они широко представлены в диете, и допустимое потребление этого полисахарида составляет в среднем 250 мг в день на человека.

Изучена возможность использования каррагинанов в качестве препаратов, модифицирующих биологическую активность ЛПС. Так как проявление активности каррагинанов определяется их структурным типом и его физико-химическими свойствами, были использованы каррагинаны нескольких структур, выделенные и охарактеризованные, как описано выше

В экспериментах т vivo было установлено, что каррагинаны повышают резистентность мышей к токсическому действию ЛПС Анализ проведенных экспериментов показал, что к- и к/(3- каррагинаны оказывают защитный эффект на животных, что выражается в увеличении процента выживаемости и средней продолжительности жизни мышей, по сравнению с контрольной группой. Степень защиты зависит от структурного типа каррагинана, концентрации и времени его воздействия Наилучший защитный эффект наблюдается при предварительной обработке мышей к-каррагинаном При внутрибрюшинном введении к-каррагинана мышам за 7 дней до инъекции ЛПС, а также при инъекции смеси ЛПС с каррагинаном смертность животных была ниже, чем при введении этого каррагинана в тех же дозах за 24 часа до инъекции ЛПС Токсичность ЛПС, рассчитанная на основании экспериментальных данных, снижается почти в 2 (б/п мыши) и 1,5-2 раза (мыши линии Balb/C) в случае предобработки мышей каррагинаном (Табл 11)

Таблица 11 Токсичность ЛПС с к-каррагинаном

Тип мыши LD so ЛПС, мкг/мышь ¿£>50ЛПС мкг/мышь (каррагинан за 7 дней до ЛПС) LD so ЛПС мкг/мышь (смесь ЛПС и каррагинана)

Инбредные 0,65 1,9 1,3

Balb/c 0,4 0,6 -

Препараты, ингибирующие токсическое действие эндотоксинов, могут быть протекторами тромбоцитов в условиях эндотоксинемии. Действительно, при предварительной инкубации к- и Х-каррагинанов с тромбоцитами донора, наблюдалось достоверное снижение степени АДФ-индуцированной агрегации: на 37,8% (р<0,05) при действии к- и на 33,7% (р<0,05) Х-каррагинана

Непосредственное введение ЛПС из S typhimurmm (200 мкг/мл) в плазму, обогащенную тромбоцитами, с дальнейшим добавлением АДФ приводит к увеличению степени агрегации тромбоцитов до 109,5% (р< 0, 05), в то время как предварительное введение каррагинана в богатую клетками плазму отменяет этот эффект, и степень агрегации тромбоцитов в этом случае снижается до 80%. Предварительная инкубация тромбоцитов с каррагинанами (как к-, так и Х-типов ) снижает величину АДФ-агрегации в условиях действия на клетки ЛПС из Е colt в среднем на 15%, что также свидетельствует о выраженных защитных свойствах этого полисахарида.

Для изучения механизма ингибиторного действия каррагинана на токсичность ЛПС в опытах т vivo была определена способность каррагинана и его смесей с ЛПС (1 1 в/в) индуцировать синтез цитокинов в иммунокомпетентных клетках.

20С 15С

юс

1

50

Концентрация

1 1100 нг/мл i 110 нг/мл

НН 0 нг/мл

"i*

1 2 3 4 5 6

Рис 20 Индукция синтеза ИЛ- 6 под действием 1-ЛПС; 2,3 смеси ЛПС с к- и к/р -каррагинанами, 4,5- к- и к/р -каррагинанами; 6- контроль (физ р-р)

Рис 21 Индукция синтеза ИЛ-8 НЕК 293 клетками, трансфици-рованными ТЬЯ4/М02, под действием 1 - ЛПС; 2 - к-кар-на (10 нг/мл), 3 - смеси к -кар-н/ЛПС 1 1, (10 нг/мл), 4 Х-кар-на (10 нг/мл1- 5 - смеси Х-кап-н/ЛПС 1 1

При изучении действия каррагинанов и их смесей с ЛПС на способность к индукции ФИО мононуклеарными клетками человека было установлено, что к- и X-каррагинаны индуцируют дозозависимый синтез ФИО, подобно ЛПС, но в значительно меньшей степени, чем ЛПС Способность ЛПС в смеси с к-каррагинаном влиять на синтез ФИО зависит от исходной концентрации ЛПС Действие к/Д-каррагинана на синтез клетками ФИО является очень слабым, а активность ЛПС в смеси с к/ß -каррагинаном сопоставима с действием исходного ЛПС

Сравнительный анализ способности ЛПС и ею смеси с каррагинанами индуцировать синтез ИЛ-6, который согласно последним данным относится к , противовоспалительным медиаторам, показал увеличение активирующего

действия ЛПС на продукцию ИЛ-6 при его смешивании с к- и к/ß- каррагинанами (Рис 20).

Эксперименты с использованием трансфицированных клеток почек человека, экспрессирующих ряд TOL-Like рецепторов, свидетельствуют о том, что активация клеток каррагинаном происходит через специфические для ЛПС рецепторы, в большей степени TLR2 и TLR4 к-Каррагинан менее эффективно активирует клетки, экспрессирующие рецепторы TLR4, но в комбинации с ЛПС его способность индуцировать синтез ИЛ-8 возрастает очень существенно (Рис 21) Для Х- каррагинана это свойство выражено незначительно Таким образом, цитокин-индуцирующая активность каррагинана может вносить важный вклад в его способность модулировать токсические свойства ЛПС.

Модификация биологических свойств ЛПС в присутствии каррагинана может быть обусловлена как самостоятельным иммуномодулирующим эффектом каррагинана, так и результатом взаимодействия полисахарида с ЛПС. Была оценена возможность неспецифического взаимодействия каррагинана с ЛПС методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и электронной микроскопии Для этих целей использованы ЛПС из Е сок, k/i-, к/ß- и X-каррагинаны из вегетативных форм водорослей С pinmdatw, Т crinitm и С armatus соответственно, и их смеси ЛПС/ каррагинан Г1, 1:1,5, 1'2, ГЗ (в/в), полученные при 20°С и инкубированные при комнатной температуре или при 37°С в течение 48 часов

Результаты, полученные методом ВЭЖХ, свидетельствуют об изменении молекулярно-массовых характеристик каррагинана и ЛПС при их смешивании, что следует из анализа профилей выходных кривых этих полимеров на хроматографической колонке Asipark CS-620 Как видно из рис 22, время выхода каррагинана в смеси ЛПС/каррагинан сдвигается в сторону уменьшения (с 16 2 до 14 5 min), что свидетельствует об увеличении его молекулярной массы При этом площадь пика, соответствующего ЛПС, уменьшается, что может быть результатом л перехода части вещества в область меньших молекулярных масс. С увеличением

количества каррагинана в смеси (при прежней концентрации ЛПС) площадь пика, соответствующего ЛПС (12 min), существенно уменьшается При двукратном избытке каррагинана (соотношение ЛПС/каррагинан 1 2 в/в) выходные кривые * представлены практически одним пиком, время выхода которого (15,6 mm)

соответствует веществу с молекулярной массой, промежуточной между значениями молекулярных масс каррагинана и ЛПС

Рис 22 Профили выходных кривых, полученные ВЭЖХ на колонке Asipark CS-620, для . а ЛПС , б - кЛ-каррагинана, в,г - смесей ЛПС и кЛ-каррагинана (11 в/в - в, и 1:2 - г). Растворитель Ü.1M NaCl

Полученные данные позволяют предположить наличие неспецифического взаимодействия между ЛПС и каррагинаном, приводящего к изменению их физико-химических характеристик Подобная картина наблюдается и при смешивании ЛПС с к/р-каррагинаном, молекулярная масса которого больше, чем у кЛ-каррагинана Следует отметить, что анализ хромагограмм, полученных для смеси X-Kappai инана с ЛПС, был затруднен и не укладывался в схему, наблюдаемую в случае к- и к/ß- каррагинанов

Для изучения влияния каррагинана на ультраструктуру ЛПС было проведено сравнительное электронно - микроскопическое исследование каррагинана, ЛПС и их смсси Как показали результаты, к- и к/р-каррагинаны образуют упорядоченные объемные сотообразные структуры, похожие на кристаллическую решетку ЛПС из Е coli при 20°С проявляет полиморфизм и образует ламеллярные лентоподобные и мембраноподобные структуры При выдерживании смеси каррагинана с ЛПС 48 часов при 20°С лентоподобные структуры не обнаруживаются, и вместо упорядоченной сстки, характерной для каррагинана, видна рыхлая сетчатая структура, перекрученная в различных местах, внутри которой наблюдаются частицы различных форм Изменение морфологии как ЛПС, так и каррагинана при их смешивании может быть результатом их взаимодействия

Хотя трудно представить, что ЛПС, несущий на своей поверхности отрицательный заряд, и каррагинан, относящийся к полианионам, будут взаимодействовать друг с другом, однако полученные результаты свидетельствуют о взаимном влиянии этих полимеров на физико-химические характеристики друг друга, что не исключает наличия такого взаимодействия с учетом нескольких факторов.

Рис 23. Электронная микроскопия ЛПС из Е. сок - а; к/|3-каррагинан - б; к-каррагинана - в; смеси ЛПС и к/р-каррагинана (1:1 в/в) - г. Окрашивание 2% ФВК. Масштаб: 1см=100нм

Прежде всего, следует обратить внимание на то, что в к- и к/р-каррагинанах, используемых в эксперименте, содержание сульфатных групп невелико (одна сульфатная группа на дисахаридное звено в к- и, в среднем, два дисахаридных звена в к/р-каррагинанах) Кроме того, наличие ионной силы (связывание происходит при физиологических условиях, в 0,1 М растворе №С1) обеспечивает снижение электростатического отталкивания и возможность межмолекулярной ассоциации Такая межмолекулярная ассоциация, характерная для этих типов каррагинанов, приводящая к формированию двойной спирали и к экранированию отрицательных зарядов, прежде всего может проявляться в растворах к- и кЛ-каррагинанов в присутствии ионов N3 При исследовании взаимодействия каррагинанов с фосфолипидными бислоями (димиристоилфосфатидилхолином) в растворах различной ионной силы было показано, что ассоциаты каррагинанов могут адсорбироваться на поверхности бислоя, а во взаимодействии кислых полисахаридов с липидными нейтральными монослоями могут принимать участие гидрофобные и водородные связи Организация в полисахаридах гидрофобных доменов, обусловленная конформацией полимерной цепи, выявлена для таких полисахаридов, как хитозан Сопоставление этих литературных данных и собственных результатов, приведенных выше, позволяет говорить о взаимодействии каррагинана с ЛПС Можно предположить, что это взаимодействие имеет неспецифический характер и осуществляется как за счет адсорбции каррагинана на поверхности агрегатов ЛПС, так и за счет водородных и гидрофобных связей Наблюдаемая на электронных фотографиях упорядоченная структура к- и к/р-каррагинанов в присутствии ЛПС принимает форму рыхлой сетки, что может быть результатом их взаимодействия Необходимо отметить, что

Х-каррагинан, цепи которого не образуют двойных спиралей, вероятно, не может создавать дополнительных связей с ЛПС. Кроме того, в Х-каррагинане плотность сульфатных групп довольна высока, что может, в свою очередь, препятствовать его взаимодействию с ЛПС за счет сил электростатического отталкивания.

Влияние каррагинана и хитозана на неспецифическую резистентность организма при ЛПС - индуцированной эндотоксинемии

Общеизвестно, что эндотоксины, кроме специфических, также вызывают ряд неспецифических патофизиологических изменений систем организма. В связи с тем, что токсическая активность ЛПС при его избытке, когда возможности защитных систем организма истощены, проявляется в острых или вялотекущих воспалительных процессах, было изучено профилактическое действие каррагинана и хитозана на неспецифическую резистентность организма мышей при бактериальной интоксикации, которую моделировали внутрибрюшинным однократным введением ЛПС Е coli в дозе 1 мг/кг. Предварительно в течение 5 дней мыши внутрижелудочно, один раз в сутки получали хитозан или каррагинан в дозе 100 мг/кг. Эвтаназию животных осуществляли через сутки после введения ЛПС. Изменение биохимических и патоморфологических показателей свидетельствует о выраженной стресс-реакции мышей на введение ЛПС (Табл. 12).

Таблица 12 Влияние хитозана и каррагинана на некоторые показатели стресс-реакции мышей при интоксикации ЛПС.

Показатель Группы животных

Норма ЛПС ЛПС + хитозан ЛПС+каррагинан

МАССА ОРГАНОВ

Тимус, мг/100г м/т 130,2+5,2 90,4+3,9 120+5,8 110,2+4,0

Надпочечник 15,4+0,31 18,0+0,52 15,8+0,42 14,3+0,62

Мг/100м/т

СЫВОРОТКА КРОВИ

Кортикостерон 0,30+0,02 0,41+0,03 0,33+0,02 0,35+0,02

мкмоль/л

ПЕЧЕНЬ

Гликоген мкмоль/г 215,3+10,8 146,6+8,2 188,8 +11,6 178,5+10,2

Лактат мкмоль/мг 1,48+0,07 1,97+ 11 1,52 + 0,12 1,65 +0,10

МДА нмоль/мг 5,2+ 0,28 7,1+0,53 6,0 + 0,42 6,4+0,38

Биохимические и патоморфологические показатели, представленные в таблице 12, свидетельствуют о том, что организм под влиянием хитозана и каррагинана способен гораздо успешнее противостоять токсическому действию бактериального эндотоксина Оба полисахарида проявляют при этом сходное фармакологическое действие На уровне целостного организма впервые показано, что хитозан и каррагинан оказывают влияние на ряд неспецифических процессов, характерных для ответа организма на ЛПС - индуцируемую эндотоксинемию.

Использование каррагинана в терапии пищевых токсикоинфекций.

Медико-биологические испытания

В странах ЕЭС, США, Японии каррагинан признан полезным и безопасным веществом и разрешен для применения в качестве пищевой добавки Экспертным комитетом по пищевым добавкам ВОЗ Нами разработаны и утверждены Приморским центром Гос Комитета РФ по стандартизации, метр'оло1ии и сертификации ТУ (№9284-037-02698170-99) на получение каррагинана из водоросли С агтаШх в качестве пищевой добавки Наличие такого документа, а также согласие Этического комитета ГУ ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ позволило провести изучение терапевтического эффекта к-каррагинана на течение пищевых токсикоинфекций (ПТИ) сальмонеллезной этиологии на базе 2-ой Клинической инфекционной больницы Москвы.

Известно, что при ПТИ развивается диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС-синдром) со значительным повреждением тромбоцитов. Было исследовано влияние каррагинана на тромбоциты больных ПТИ. Введение ЛПС из 5 1урЬтипит в обогащенную тромбоцитами плазму больного на фоне АДФ, вызывает существенную, по сравнению с донорами, активацию клеток (до 133%) Предварительное введение каррагинана в плазму больного перед добавлением ЛПС и АДФ ингибирует активирующее действие ЛПС, практически отменяет его В этом случае агрегация тромбоцитов составляет 103% (за 100%-ную норму принята АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов больных) Последние данные имеют особый практический интерес, так как показывают возможность защиты каррагинаном тромбоцитов больных различными бактериальными инфекциями.

Пероральное введение каррагинана с раствором хлосоль в дозе 150мг/сутки в 3 приема в течение первых двух суток терапии проведено 49 больным ПТИ. Контрольную группу (31 человек) составили больные, получавшие базовую терапию (солевые растворы) без каррагинана Результаты оценивали по данным клинического течения болезни и параметрам систем гемостаза и иммунитета

Пероральное введение каррагинана больным с ПТИ на фоне стандартной терапии более активно, по сравнению с контрольной группой, восстанавливает систему гемостаза При этом действие препарата носит модулирующий (регуляторный) характер у больных с гиперкоагуляцией отмечается снижение агрегационной активности тромбоцитов, в среднем, на 65% (р<0,01), а у больных с гипокоагуляцией степень агрегации возрастает на 22% (р<0,001)

Действие каррагинана на иммунный статус оценивалось по изменению следующих показатели общий лейкоцитоз, процентное сокращение и абсолютное количество лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов, количество эритроцитов, общее содержание гемоглобина и гематокрита, средний объем эритроцитов, среднее содержание и концентрация гемоглобина в эритроцитах группы пациентов, получавших каррагинан На четвертые сутки лечения наблюдается снижение лейкоцитоза, увеличение процентного и абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови, рост содержания общей популяции Т-лимфоцитов (СОЗ+), иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (СОЗ+/СБ4+ и С03+/С08+), уменьшение количества активированных клеток до нормальных значений В контрольной группе больных эти показатели не восстанавливаются за данный период Достаточно быстрое восстановление показателей иммунной системы при приеме каррагинана, вероятно, обусловлено его иммунорегуляторными свойствами

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о положительном эффекте каррагинана на функциональную активность тромбоцитов в условиях эндотоксинемии у больных ПТИ сальмонеллезной этиологии Отмечено также корригирующее влияние препарата на некоторые биохимические показатели, характеризующие состояние гомеостаза, и на восстановление статуса иммунной системы у исследуемых больных.

Полученные в результате проведенного исследования данные позволяют надеяться на эффективное использование каррагинана в комплексной терапии различных форм бактериальных инфекций и эндотоксинемии

ВЫВОДЫ

1 Из бактерий У pseudotuberculosis выделены два эндотоксина - ЛПС и ЛПС - белковый комплекс (ЛПБК) Установлено, что в составе комплекса ЛПС имеет в среднем более длинную О-специфическую углеводную цепь, по сравнению с ЛПС, свободным от белка Эта закономерность становится более выраженной при низкой температуре культивирования бактерий У pseudotuberculosis .

2. Показано, что в водных растворах ЛПС и ЛПБК формируют высокомолекулярные и полидисперсные агрегаты, размеры, форма, ультраструктура и молекулярно-массовое распределение которых зависят от концентрации полимера, ионной силы и температуры раствора. Определены их физико-химические характеристики и изучено поведение в растворах В надмолекулярной организации ЛПС и ЛПБК участвуют ионы двухвалентных металлов, водородные связи и гидрофобные взаимодействия.

3 Физико-химические и биологические свойства ЛПБК в основном определяются ЛПС-составляющей Белковому компоненту также принадлежит важная роль в структурной организации комплекса и проявлении его физиологической активности Надмолекулярные структуры ЛПС и ЛПБК оказывают заметное влияние на их физиологическую активность.

4 Впервые изучено взаимодействие в растворах ЛПС с хитозаном на молекулярном уровне и показана важная роль надмолекулярной структуры ЛПС в этом процессе Установлено влияние температуры, рН, ионной силы раствора, а также сгруктурных особенностей ЛПС и степени полимеризации хитозана на их взаимодействие

5 Определены параметры связывания ЛПС с хитозаном. Установлено, что ЛПС образуют с хитозаном комплексы различной стехиометрии и показано, что в образовании комплексов, наряду с электростатическим взаимодействием, принимают учас!ие водородные связи.

6. Установлено, что токсичность ЛПС существенно снижается при образовании им комплекса с хитозаном Показано, что хитозан модифицирует иммунобиоло1 ические свойства ЛПС

7. Проведено комплексное изучение сульфатированных полисахаридов карра! инанов, выделенных из красных водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae Усыновлена структура и изучены физико-химические свойства различных I ипов каррагинанов. Впервые определена зависимость структуры каррагинанов от стадии развития этих водорослей

8. Показано, что каррагинаны взаимодействуют с ЛПС и изменяют его надмолекулярную организацию Этот процесс зависит от структурного типа каррагинана.

9. Установлено, что каррагинаны уменьшают токсическое действие ЛПС в экспериментах т vivo и in vitro и изменяют его биологические свойства Показано, что проявление физиологической активности ЛПС зависит от структуры каррагинана.

10 Впервые получен положительный эффект при применении каррагинана в терапии больных пищевыми токсикоинфекциями сальмонеллезной этиологии. Показано, что на фоне стандартной терапии пероральное ведение каррагинана более активно, по сравнению с контрольной группой, восстанавливает параметры системы гемостаза, гомеостаза и показатели иммунной системы больных

11. Показано, что каррагинан и хитозан повышают неспецифическую резистентность организма при ЛПС-индуцированной эндотоксинемии в опытах т vivo.

12. Результаты, полученные при изучении взаимодействия ЛПС с полисахаридами, позволяют рассматривать хитозан и каррагинан как перспективные вещества, которые могут быть использованы в специфической и вспомогательной терапии эндотоксинемии и эндотоксического шока

Список статей по теме диссертации:

1 Solov'eva Т F., Yermak 1 М , Bondarenko О D , Frolova G М , Ovodov Yu S . Studies on a hpopolysaccharide-protein complex from Yersinia pseudotuberculosis II Microbios 1979 Vol. 25, № 1 P 133-144

2 Ермак И M , Васильев Б К , Гладких Р В , Недашковская Г М , Шеховцова М Ф , Соловьева Т Ф , Оводов Ю С. Характеристика молекулярно-массовых параметров и вязкости растворов липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis II Химия природ соедин 1982. Т 3 С 384-388

3. Кузнецова Т. А, Ермак И.М, Горшкова РП. О некоторых аспектах биологического действия липополисахарида из бактерий псевдотуберкулеза. //в сб : Иерсиниозы Новосибирск. 1983 С 43-50.

4 Ермак И.М, Соловьева Т Ф, Судник IO.M, Оводов Ю С Седимен-тационныс свойства липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis II Биофизика 1984 Т XXIX, вып 6 С 945-948

5 Васильев Б.К , Ермак И М , Гладких Р В., Соловьева Т.Ф , Дзизенко А К. Исследование ЛПБК из Yersinia pseudotuberculosis в водных растворах методом светорассеяния //Биофизика 1985 Т XXX, вып 6. С. 981-984

6 Ермак И.М, Фролова Г.М , Соловьева Т Ф, Оводов Ю.С О различных формах липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis II Биоорган химия 1985. Т 11, №9 С 1270-1276.

7 Тимченко Н Ф , Новикова О Д , Ермак И.М, Соловьева Т Ф., Оводов Ю.С. Компоненты наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis и их роль в патогенезе псевдотуберкулеза // Ж микробиол эпидемиол. иммунобиол 1986. №6 С 38-41.

8 Ермак И М, Дроздов А Л Соловьева Т Ф, Оводов Ю.С. Физико-химические свойства и морфология липополисахарид-белкового комплекса

из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Биол. мембраны. 1986. Т.З, № 1. С. 52-59.

9 Ермак И М., Ядыкина Г М. Соловьева Т Ф., Оводов Ю.С

Исследование водных растворов липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis гидродинамическими методами // Биофизика 1988. Т.ХХХ111, вып.2. С. 288-292.

10. Соловьева Т Ф., Ермак И.М., Мороз С.И., Красикова И.Н., Новикова О.Д., Хоменко В.А, Фролова Г.М., Иванова Е.П., Тимченко Н.Ф., Оводов Ю.С Влияние температуры культивирования на состав компонентов внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Биол. мембраны. 1988. Т.5, №5. С. 492-500.

11. Ovodov Yu.S., Solov'eva T.F., Khomenko V.A , Novikova O.D., Frolova G.M., Yermak I.M., Naberezhnykh G. A. Ponn as component of Yersinia pseudotuberculosis endotoxin // Endotoxin Adv. Exp. Med. Biol. 1990.Vol.256. P. 185-187.

12. Ермак И.М , Соловьева Т.Ф., Оводов ЮС. Изучение термотропного поведения липополисахарида и липополисахарид-белкового комплекса из Yersinia pseudotuberculosis методом седиментации // Биол. мембраны. 1990. Т.7, № 5. С. 462-466.

13. Соловьева Т.Ф., Бахолдина С.И., Ермак И.М., Хоменко В.А., Федореева ЛИ., Новикова ОД., Фролова Г.М., Лихацкая ГН, НФ, Оводов Ю.С. Характеристика белкового компонента эндотоксина из Yersinia pseudotuberculosis II Биоорган, химия. 1990. Т.16, № 10. С. 1601-1309.

14. Ермак И.М., Бахолдина С.И., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф, Фурман В.Я., Стуруа Г.И., Геденеванишвили Г.И. Физико-химическая характеристика эндотоксина из Yersinia pseudotuberculosis и его компонентов // Изв. АН Грузии. 1991. Т.17, № 1. С 65-71

15. Ермак И.М., Мороз СИ., Соловьева Т.Ф, Оводов Ю.С.. Сравнительная характеристика эндотоксинов, выделенных последовательной экстракцией из Yersinia pseudotuberculosis II Ьиол. мембраны. 1991. Т.8, № 2. С. 128-133.

16 Новикова О.Д., Федореева Л.И , Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Мороз С.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С.. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию // Биоорган, химия. 1993. Т. 19, №5. С. 536-547.

17. Ермак И.М., Горбач В.И., Полякова A.M., Астринан ОС., Лукьянов П.А., Соловьева Т Ф., Малеев В В., Оводов Ю.С. Растворимый комплекс липополисахарид-хитозан и его влияние на агрегацию тромбоцитов // Биол. мембраны. 1994. Т.11, № 5. С. 496-500.

18 Yermak IM, Naberezhnykh G.A., Solov'eva T.F, Drozdov A.L., Ovodov »

Yu S The effect of temperature on supramolecular structure and antigenic activity of Yersinia pseudotuberculosis endotoxin // J Biochem. Organization. 1994. Vol.1, №4. P. 295-304.

19. Полякова A.M , Кравченко A.B , Ермак И M , Горбач В.И., Астрина О.С., '

Лукьянов П А , Соловьева Т Ф , Малеев В В , Оводов Ю.С. Влияние хитозана на биологические свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий//Бюл. эксперим. биол мед 1995. Т СХХ, №8. С. 169-172.

20. Solov'eva T F, Elyakova L.A, Zvyagintseva T N, Yermak IM Polysaccharides from the Russian Pacific Coast algae and their enzymatic transformation//J Marine Technol Soc. 1996. Vol. 30, №.1 P 35-39

21 Ермак И M, Хотимченко Ю.С. Физические и химические свойства, применение и биологическая активность каррагинана, полисахарида красных водорослей // Биол. моря. 1997. Т. 23, №3 С 109-122

22. Mi-Sun Hong, Yong-Hwan Kim, Irina M. Yermak. The characterization of polysaccharides from Tichocarpus crimtus II Korean J. Fd Nutr 1997. Vol.11, №1. P. 99-106.

23. Давыдова BH, Ермак ИМ, Горбач ВИ, Соловьева ТФ Влияние температуры на процесс взаимодействия липополисахарида из Yersinia pseudotuberculosis с хитозаном //Биол.мембраны. 1999 Т 16, №1 С 42-48

24. Соловьева Т Ф., Ермак И М. Липополисахарид-белковый комплекс из бактерий псевдотуберкулеза. Структура и свойства // В кн ( В.А Стоник) Успехи в изучении природных соединений. 1999. Дальнаука С 168-178

25. Davidova V N., Yermak IМ, Gorbach V.I Solov'eva T.F. The effect of temperature on the interaction of Yersinia pseudotuberculosis lipopolysacchande with chitosan // Membr Cell Biol. 1999 Vol.13, №1.P 49-58

26. Yermak I M., Titlyanov E.A , Kim Y H , Solov'eva T F Chemical structure and gel properties of carrageenans from algae belonging to the families Gigartmaceae and Tichacarpaceae and collected from the Russian Pacific Coast Hi Appl. Phycol 1999. Vol 11, №1.P.41-48

27 Давыдова B.H., Ермак И M., Горбач В И., Дроздов А Л , Соловьева Т Ф Сравнительное изучение физико-химических свойств хитозанов различной степени полимеризации в нейтральных водных растворах // Биофизика. 2000. Т.45, № 4 С 624-630.

28 Давыдова В.Н , Ермак И.М , Горбач В И , Красикова И Н. Соловьева Т.Ф . Взаимодействие бактериальных эндотоксинов с хитозаном. Влияние структуры эндотоксина, молекулярной массы хитозана и ионной силы раствора на процесс комплексообразования // Биохимия. 2000 Т 65, вып.9 С 1278-1287.

29 Yakovleva I.M , Yermak I М., Titlyanov Е.А., Barabanova А О , Clazunov P. Changes in growth rates, anatomy and polysaccharide content of a steril form of Tichocarpus crimtus under differing photon irradiance in the Sea of Japan (Russia)//Bot Mar 2001 Vol 44, № 5. P 491-497

30. И M. Ермак, H.B Ситун, В П. Дедюхина, Соловьева Т.Ф Физико-химические характеристики каррагинанов из дальневосточной красной Chondrus armatus и их смесей с молочными белками // Раст ресурсы 2002, вып.З. С 98-106.

31 Yermak I М , Chotimchenko Yu S Chemical properties, biological activities and applications of carrageenan from red algae //in Recent Advances in Marine Biotechnology" (Fingerman V, and Nagabhushaman R, eds) Sci Publ. Inc USA-UK. 2003 Vol. 9. P 207-250

32 Заводинский ВГ, Гниденко A.A., Давыдова В.П., Ермак ИМ. Компьютерное моделирование взаимодействия бактериально! о эндотоксина с поликатионом - хитозаном // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения 2003 №2 С 12-14

33 Barabanva A.O., Yermak I. M., Glazunov V P, Yakovleva I. M , Kim Yong Hwan, Solov'eva T. F Influence of life-history stage and photon irradiance on yield and quality of carrageenan in Tichicarpus crimtus (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Jap. J Phycol. 2004. V.52 P. 61-65.

35. Полякова A.M., Ермак И M., Астрина О С., Малеев В.В , Горбач В И , Соловьева Т.Ф. Влияние биологически активных природных полисахаридов на функциональную активность тромбоцитов в условиях экспериментальной эндотоксемии // Инфекц болезни. 2003 Т. 1, № 1 С. 80-82.

36 Ермак И M , Давыдова В Н., Горбач В И , Бердышев Е Л., Кузнецова Т.А., Иванушко И А., Гажа А К , Смолина Т П., Запорожец Т.С., Соловьева Т Ф. Модификация биологических свойств липополисахарида (ЛПС) при образовании им комплекса с хитозаном // Бюл эксперим. биол. мед. 2004. Т. 137, № 7. С.430-434.

37 Сгребнева М.Н , Хасина Э И., Оводова Р Г , Ермак И М., Давыдова В.Н., Оводов Ю С. Влияние полисахаридов зостерина и хитозана, - на белок-синтезирующую функцию гепатоцитов // Исследовано в России [Электронный ресурс] 2004 Т. 211. С. 2230-2239.

38. Хасина Э.И, Сгребнева М.Н., Ермак И.М., Горбач В И. Хитозан и неспецифическая резистентное гь организма // Вест. ДВО РАН 2005 №1. С. 62-71

39 Хотимченко Ю С , Ермак И.М , Бедняк А.Е , Хасина Э И., Кропотов А В , Коленченко Е.А., Сергущенко И.С. Фармакология некрахмальных полисахаридов // Вест ДВО РАН. 2005. № 1. С. 72-82.

40 Ермак И M , Рсунов А В., Лапшина Л А., Давыдова В Н., Соловьева Т.Ф. Электронно-микроскопическое изучение ЛПС из грамотри нательных бактерий и их комплексов с хигозаном // Биол. мембраны. 2005 Т 22, № 2 С. 117-122

41 А.О.Барабанова, И М. Ермак, В.П. Глазунов, В В. Исаков, Э.А Титлянов,

Т Ф. Соловьева Сравнительная характеристика каррагинанов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм водоросли Tichocarpus■ ermitus (Gmel.) Rupr/ ( Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Биохимия. 2005. T.70, №3 C.430-437.

42. Полякова A M , Астрина О С., Бахтина IO.A , Малеев В.В., Барабанова А.О , Ермак И.М Возможность коррекции функционального состояния тромбоцитов человека с помощью природных полисахаридов в условиях экспериментальной эндоюксинемии и у больных пищевыми токсикоинфскциями // Инфекц. болезни. 2005 Т. 3, № 1. С.44-46.

43. Ермак И.М., Барабанова А О , Кукарских Т А., Соловьева Т.Ф , Бо1данович P.H , Полякова A M , Астрина О П., Малеев В В Природный полисахарид каррагинан как ингибитор токсического действия эндотоксинов грамотрицатсльных бактерий // Бюл. эксперим. биол. мед 2006 Т.141, №2 С.1-6.

44 Yermak I.M., Davidova V N , Gorbach V I., Luk'yanov P.A., Solov'eva T.F., Ulmer Arthur J., Buwitt-Beckmann U., Rietschel E.T, and Ovodov Yu.S. Forming and immunological properties of some lipopolysaccharide-chitosan complexes//Biochimie. 2006 Vol 88, №1 P.23-30.

45 Давыдова В.Н , Набережных Г А , Ермак И М , Горбач В И , Соловьева Т Ф Определение констант связывания ЛПС различной структуры с хитозаном // Биохимия. 2006. Т.75, № 3. Р. 300-347.

46. Yermak I.M , Barabanova А О ,Glazunov V Р , Isakov V V, Kim Yong Hwan, Shin Kwang Soon, Titlynova T.V., Solov'eva T F. Carrageenans from cystocarpic and sterile plants of Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae, Rhodophyta) collected from the Russian Pacific Coast // J Appl Phycol 2006. Vol. 22. № l.P. 1-8.

Соискатель

к.х н. Ермак И. M.

Ирина Михайловна ЕРМАК

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ С БЕЛКАМИ И ПОЛИСАХАРИДАМИ, МОДИФИКАЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ

Автореферат

Изд лиц ИД № 05497 от 01 08 2001 г Подписано к печаги 07 09 2006 г Формат 60x90/16 Печать офсетная. Усл. п. л. 3,0 Уч-изд л 2,92 Тираж 100 экз. Заказ 129

Отпечатано в типографии ФГУП Издательство «Дальнаука» ДВО РАН 690041, г Владивосток, ул Радио, 7

Содержание диссертации автор научной статьи: кандидата педагогических наук, Ватутин, Алексей Васильевич, 2006 год

Введение.

Глава 1. Теоретические аспекты природоохранительного воспитания учащихся в русской школе во второй половине XIX века

1.1. Историко-педагогические предпосылки разработки теоретических аспектов природоохранительного воспитания учащихся в русской школе во второй половине XIX века.

1.2. Разработка проблемы природоохранительного воспитания учащихся в народной школе.

Глава 2. Природоохранительное воспитание учащихся русской народной школы в процессе обучения.

2.1. Реализация задач природоохранительного воспитания учащихся в учебной литературе.

2.2. Методы и формы природоохранительного воспитания учащихся в русской народной школе.

Введение диссертации по педагогике, на тему "Природоохранительное воспитание учащихся в русской народной школе во второй половине XIX века"

Актуальность и постановка проблемы. Глобальный экологический кризис, характеризующийся напряженными взаимоотношениями между человеком и природой, активизировал внимание Российского правительства, общественных организаций и ученых к разработке и принятию пакета документов {закон РФ «Об охране окружающей природной среды» (1991), закон «О государственной политике в области экологического образования» (1991), Положение «Всемирной стратегии охраны ii) природы» (1991), общественно-экологический кодекс (1995), программа «Экологическое образование населения России» (1995), «Концепция экологической безопасности России, направленных на охрану природы и безопасности жизни и деятельности человека. В «Концепции экологической безопасности России» сформулировано понятие «экологическая безопасность». Оно трактуется как «состояние защищенности личности, общества, государства и окружающей природной среды от реальных и постоянных угроз антропогенного или естественного происхождения, воздействующих на биосферу» [97, 17]. Экологические проблемы, их глобальный характер и своеобразное проявление в каждом регионе планеты убеждают в необходимости сознательного, ответственного отношения человека к природе, отказа от устоявшихся представлений о неисчерпаемости природных богатств и возможности её покорения. Несмотря на то, что глобальные проблемы рассматриваются как результат взаимовлияния экономики и техники, а человек - как жертва их развития, в обществе постепенно формируется мнение о том, что судьба мира зависит от человека, его личностных качеств, ценностных ориентаций, отношения к природе и р способов поведения с ней.

Однако сам человек, как отмечает А.И. Субетто, не готов предвидеть последствия своей деятельности. Ученый с сожалением отмечает, что человек не успевает адаптироваться к новым условиям жизни, отстает в понимании себя, своей природы, своего интеллекта и законов становления ноосферы. В связи с этим растет запаздывание реакции со стороны человека на происходящие катастрофические изменения в природе в целом и во внутренней природе человеческого организма.

Выход из сложившейся ситуации ученые (JI.A. Зятева, Н.С. Деж-никова и др.) видят в экологическом воспитании, целью которого является сформированное убеждение тесной связи человека с природой, биологической и духовной зависимости от неё. Обязательность экологического воспитания закреплена законом РФ «Об охране окружающей природной среды». В нем сказано: «Овладение минимумом экологических знаний, необходимых для формирования экологической культуры граждан во всех дошкольных, средних и высших учебных заведениях независимо от их профиля, в процессе изучения основ экологических знаний» [77,16].

Реализация правительственных документов стала возможной при определении нового направления в работе общеобразовательной школы - экологического воспитания учащихся, над разработкой содержания которого работают А.Н. Захлебный, И.Д. Зверев, И.Т. Суравегина, А.А. Плешаков и др.

С учетом современных требований к экологическому воспитанию и теоретических исследований была разработана Базисная программа экологического образования (1999 г.). Её содержание ориентирует на реализацию следующих задач:

• разработка национальных концепций интеграции социально-экономического развития и охраны окружающей среды;

• изменение сознания человека и стереотипов поведения;

• поощрение социальной заинтересованности общества в сохранении среды обитания.

Результативность в достижении целей, поставленных программой, возможна только при реализации целостного подхода, включающего в качестве необходимого компонента изучение теоретического наследия и положительного опыта природоохранительного воспитания в русской народной школе во второй половине XIX в. Уникальность данного опыта состоит в том, что он явился результатом интеграции теоретических разработок на основе практической деятельности известных педагогов Н.Ф. Бунакова, С.И. Миропольского, С.А. Рачинского, JI.H. Толстого, К.Д. Ушинского, и др. Русская народная школа давала учащимся знания по основам грамматики, арифметики, естествознания, географии, истории, метереологии, геологии, логики, анатомии, земледелия и т.д.; формировала духовно-нравственные убеждения и навыки практического поведения. Весь этот комплекс мероприятий был направлен на обеспечение бережного отношения к окружающему миру, людям и себе и позволял готовить учащихся к жизни.

В.И. Водовозов, JI.H. Модзалевский, А.Н. Острогорский, К.Д. Ушинский, С.А. Рачинский и др. убедительно показали роль знаний в формировании любви и бережного отношения детей к природе. Анализ их трудов позволяет целостно представить процесс воспитания, который сегодня получил название экологического образования.

Отдельные аспекты этого процесса проанализированы и представлены в трудах отечественных педагогов: И.Н. Бабкина, Е.П. Белозерцева, М.В. Богуславского, З.В. Видяковой, JI.H. Голубевой, О.В. Долженко, С.Ф. Егорова, А.И. Еремкина, А.Б. Измайловой, В.П. Кузовлева, B.C. Кумарина, Е.Н. Медынского, В.М. Меньшикова, JI.H. Модзалевского, А.Н. Острогорского и др.

Проблемам природоохранного воспитания в теории и практике народной школы посвящены и диссертационные исследования: М.Г. Ахме-довой (1997), А.Ю. Белогурова (1997), Р.В. Степанец (1998), Л.В. Весениной (1998), А.П. Романова (2003) и др.

Анализ современной учебной литературы показывает, что некоторые положения по природоохранному воспитанию в XIX веке, предложенные известными учеными, учитываются в современной педагогической и учебной литературе. Например, идеи Н.Ф. Бунакова, К.Д. Ушинско-го, JI.H. Модзалевского используются в системе интегрированных учебных курсов А.А. Плешакова «Зеленый дом», в вариативном курсе З.А.Клепининой «Природа и люди», в образовательной программе «Школа 2100» (курс «Мир и человек» А.А. Вахрушева, А.С. Раутиана).

В условиях отказа от коммунистических идеалов и демократизации общества педагоги обратились к созданию русской школы (Е.П. Белозер-цев, Троицкий, В.М. Меньшиков и др.). Одним из аспектов современной русской школы является природоохранительное воспитание учащихся, в разработке которого необходимо учитывать историко-педагогический опыт. Однако до сих пор не было исследований, целью которых являлось бы целостное изучение проблемы природоохранительного воспитания учащихся в русской народной школе во второй половине XIX века и использование его идей в современной практике экологического образования младших школьников. С учетом выявленного противоречия была сформулирована проблема исследования: каковы основные положения природоохранительного воспитания учащихся в народной школе во второй половине XIX века и как они могут быть использованы в современном экологическом образовании младших школьников. Решение этой проблемы составляет цель исследования.

Объект исследования - русская народная школа во второй половине XIX века.

Предметом исследования является природоохранительное воспитание учащихся в русской народной школе во второй половине XIX века.

В соответствии с проблемой, объектом, предметом и целью исследования были поставлены следующие задачи:

- раскрыть цель, задачи, содержание природоохранительного воспитания учащихся в народной школе во второй половине XIX века;

- выявить компоненты содержания природоохранительного воспитания учащихся;

- определить педагогические условия природоохранительного воспитания учащихся в русской школе;

- определить значение идей природоохранительного воспитания для современного экологического образования школьников.

Методологическую основу исследования составляют положения современной философии и науки, рассматривающие мир с точки зрения его исторического развития, единства бытия человека и природы, целостности физической, психической и духовной природы человека при формировании эколого-нравственного мировоззрения личности. Основополагающими принципами являлись достоверность и объективность фактов, связь истории с современностью, диалектика общего, особенного и единичного, системный подход к анализу явлений воспитания и образования, выявление их прогностического значения. Основными методологическими и теоретическими ориентирами исследования служили принципы: культурологический, антропологический, аксеологический (В .И. До донов, Н.Д. Никандров, З.И. Равкин, В.А. Сластенин и др.).

Для решения поставленных задач использовался комплекс методов исследования: теоретический, логико-исторический, сравнительно-истори-ческий, ретроспективный и прогностический анализ источников, учебных книг, современных программ и учебников с экологической направленностью, систематизация, классификация и теоретическое моделирование изучаемых явлений и процессов.

Источники исследования: труды отечественных философов, психологов и педагогов; документальные и литературные материалы; издания периодической педагогической печати; учебные планы, программы, учебники, учебные и методические пособия по вопросам экологического образования школьников.

В ходе исследования были изучены материалы Государственных архивов Липецкой и Воронежской областей, архивы краеведческих музеев городов Ельца, Усмани, Задонска, Данкова.

Исследование выполнялось в несколько этапов:

I. 2002-2003 гг. - изучение литературы по данной проблеме, составление библиографии, изучение степени его разработанности в историко-педагогических исследованиях; разработка теоретической модели целостного изучения природоохранительного воспитания в русской школе, построение концептуальных основ и методов исследования;

П. 2003-2004гг. - теоретическое осмысление и обобщение полученного материала, апробация его в публикациях;

III. 2004-2006 гг. - систематизация и обобщение основных идей и результатов, литературное оформление диссертации.

Научная новизна исследования заключается в следующем:

- выявлены цель, задачи, содержание природоохранительного воспитания учащихся в народной школе во второй половине XIX века;

- выявлены педагогические условия, обеспечивающие природоохранительное воспитание учащихся в русской школе;

- целостное теоретическое осмысление позволило представить содержание, формы и методы природоохранительного воспитания учащихся в русской народной школе, которые могут найти применение в современном школьном экологическом образовании.

Теоретическая значимость исследования состоит в следующем:

-. систематизированы знания о сущности феномена «природоохранительного воспитания»;

- выявлен комплекс компонентов образующих содержание природоохранительного воспитания учащихся в русской народной школе во второй половине XIX века;

- показана органическая связь природоохранительного воспитания с общим мировоззрением и духовно-нравственным развитием учащихся русской школы во второй половине XIX века.

Практическая значимость исследования состоит в том, полученные научные данные обогащают курс истории педагогики и могут быть использованы в системе подготовки будущих учителей и повышения квалификации педагогических кадров, а также научными работниками при исследовании историко-педагогической и экологической проблематики.

Достоверность и обоснованность результатов исследования обеспечивается методологической определенностью исходных базовых позиций; применением системы методов, адекватных его задачам и логике; использованием различных источников и первоисточников, подтверждающих положения и концептуальные выводы диссертации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Во второй половине XIX века в условиях переориентации производства на промышленное производство в России было востребовано природоохранительное воспитание, целью которого являлось воспитание бережного отношения к окружающей природе и человеку. В этот период ученые обосновали ряд ценных положений о сохранении здоровья детей в процессе учебной и трудовой деятельности, многие из которых не потеряли своей актуальности и значимости. Разработанная ими теоретическая база природоохранительного воспитания была реализована не только в практике русской народной школы, но и использовалась в советской школе.

Принципиальным отличием советских программ природоохранительного воспитания являлось отсутствие духовно-нравственного компонента. Постепенно это и привело к кризису советской модели природоохранительного воспитания. В то же время сохранение остальных компонентов программы природоохранительного воспитания, взятых из опыта дореволюционных школ, обусловило успехи советской школы в этом направлении.

2. Природоохранительное воспитание учащихся в русской школе обеспечивалось соблюдением следующих педагогических условий: а) взаимосвязанностью компонентов содержания образования: научного, народного, православного, практического; б) следование педагогическим принципам: научность, доступность, наглядность, активность учащихся, связи обучения с жизнью, гуманизации, целостности процесса воспитания и обучения, учет возрастных особенностей, антропологический принцип, активность учащихся и др.; в) ориентация содержания учебных предметов на знакомство учащихся с природой и формирования убеждений в необходимости бережного отношения к ней. г) использование форм, методов и средств обучения и воспитания, позволяющих, знакомить учащихся с окружающим миром, формировать ценностное отношение к природе, людям и себе, воспитывать ответственность за сохранение окружающего мира и не разрушать его в деятельности.

3. Значение идей природоохранительного воспитания, предложенных педагогами в XIX веке, для современного экологического образования школьников заключается в целостном и многомерном изучении мира природы, с позиций научности, народности, органического единства законов «естественного и нравственного», ответственности человека за сохранение окружающей среды, воздействия природы на духовный мир человека. Особую актуальность для нашего времени имеет то обстоятельство, что природоохранительное воспитание в XIX в. рассматривалось в неразрывной связи с духовно-нравственным воспитанием.

4. Развитие грамотной речи учащихся рассматривалось учеными в контексте природоохранительного воспитания. Речь имеет значение не только как средство развития логического мышления, но и как органическое свойство человека как части природы.

В православном вероучении речь рассматривается как дар Божий, отличающая человека от животного мира. Заслуга педагогов XIX в., в частности школы К.Д. Ушинского в С.А. Рачинского, заключается в синтезе позитивных научных знаний о языке с вероучением православной церкви.

5. Выявленная нами общая картина развития природоохранительного воспитании в России во второй половине XIX в. позволяет сделать вывод о том, что к этому времени сложились благоприятные условия для создания и развития русской народной школы на всех уровнях начального, среднего и высшего образования. Это обеспечивалось целенаправленной государственной политикой, усилиями общественных и частных лиц в соответствии с задачами русской народной школы и традициями широких народных масс.

Апробация и внедрение результатов исследования. Материалы диссертации отражены в публикациях автора. Они докладывались на Всероссийской научно-практической конференции в Курске (2003), научно-практических конференциях в Липецке (2004, 2005, 2006), Усмани (2003), аспирантских семинарах JII НУ. Материалы диссертационного исследования были использованы при чтении курса истории образования в ЛГПУ, Институте развития и образования, в учебно-воспитательном процессе школьников сельских и городских школ Липецкой области.

Структура диссертации состоит из введения, двух глав, заключения, списка литературы и приложения.

Заключение диссертации научная статья по теме "Общая педагогика, история педагогики и образования"

Заключение

Экологическое образование учащихся, востребованное современной действительностью, будет более эффективным, если использовать положительный опыт по природоохранительному воспитанию учащихся в русской народной школе во второй половине XIX века, тем более что у его истоков стояли известные отечественные педагоги Н.Ф. Бунаков, С.И. Миропольский, Н.И. Пирогов, К.Д. Ушинский, С.А. Рачинский и др.

Исследование показало, что во второй половине XIX века разработка проблемы природоохранительного воспитания учащихся была обусловлена созданием русской народной школы и социально-экономическими причинами. Русскую народную школу рассматривали, с одной стороны, как главное связующее звено всей системы народного образования, а с другой стороны, как совершенно самостоятельное учебное заведение, занимающееся подготовкой учащихся к жизни. Особенность русской народной школы сказалась на определении содержания образования, учебных книгах, форм и методов обучения.

В теоретическом аспекте мы выявили основные положения природоохранительного воспитания, разработанные К.Д.Ушинским, Н.И Пиро-говым, П.Ф. Лесгафтом и др. учеными. Так, К.Д. Ушинский определил его границы, наметил основное содержание и показал, что оно должно основываться на принципах научности, народности и антропологизме.

В.И. Водовозов, А.Н. Острогорский, Н.И. Пирогов, П.Ф. Лесгафт, Д.И. Писарев, Н.А. Добролюбов, С.А. Рачинский и др., не употребляя понятия «природоохранительное воспитание», рассматривали его в контексте или воспитания, или обучения, или содержания образования в народной школе. Это можно объяснить тем, что целостный подход к воспитанию позволил им представить его объемно как средство развития молодого поколения и подготовки его к жизни (передача жизненного опыта, формирование нравственных и религиозных убеждений, определяющих и взаимоотношение человека с природой).

Особый интерес представляют вопросы, связанные с рассмотрением природоохранной проблематики в педагогической системе К.Д. Ушин-ского, места естественных наук в учебном процессе, взаимодействия естественнонаучного и религиозного воспитания, анализа дидактических и методических взглядов педагога.

Принципы педагогической системы К.Д. Ушинского, на основе которых он сформулировал положения природоохранительного воспитания, открывали перспективу для совершенно особого взгляда на мир природы, бытие человека в нем, защиту этого мира, сопереживание ему, наконец, сохранение его для будущих поколений, то есть того, что на современном этапе называется экологическим образованием. Во всех работах педагога, даже в тех, где прямо не рассматриваются вопросы природоохранительного воспитания, четко прослеживается его мировоззренческая проблематика.

Природоведческая проблематика рассматривается К.Д.Ушинским с точки зрения теории и практики. Педагог считал, что основу первоначального обучения должны составлять русский язык и литература, география, история, и изучение природы России. Такая последовательность изучения предметов будет способствовать возникновению перед глазами детей целостной картины окружающего мира, впечатлений в художественных образах (родной язык и литературное чтение) и подтвержденной примерами из истории, географии и естествознании. Значение естественных наук в образовании детей состоит в следующем: а) естествознание объясняет, как следует наблюдать за миром природы; б) сближая человека с природой, естественные науки помогают ему развивать способности, которые необходимы при изучении других предметов; в) естествознание дает представление о природных и социальных законах развития.

В исследуемый период были определены концептуальные положения природоохранительного воспитания учащихся в русской народной школе:

• Цель - формирование добрых инстинктов учащихся (стремление к идеалам правды и добра) и воспитание гражданских качеств;

• принципы (целостность процесса воспитания и обучения, учет возрастных особенностей учащихся в воспитании, научность, доступность, наглядность, активность учащихся, связь обучения с жизнью, активность учащихся), гуманизация процесса обучения и воспитания;

• компоненты природоохранительного воспитания (научный, народный, православный, практический).

В продолжение всего исследования мы имели в виду задачу раскрытия своеобразия содержания образования природоохранительного воспитания, старались определить, как и в чем конкретно это своеобразие проявилось в исследуемый период, как и в чем, проявилась его особенность в различных типах русской народной школы.

Особенность русской народной школ состояла в том, что природоохранительное воспитание осуществлялось в процессе обучения и трудовой деятельности учащихся. При этом следует отметить, что труд рассматривался как средство воспитания и развития личности. В процессе трудовой деятельности формировались нравственные качества: трудолюбие, бережное отношение к окружающему миру.

Исследование показало, что природоохранительное воспитание стало возможным благодаря изданию учебных книг, составленных великим русским педагогом К.Д.Ушинским. Заслуга его труда заключалась в том, что проблемы, поставленные и решенные им в его теоретических работах получили воплощение в содержании «Родного слова» и «Детского мира». Книги К.Д. Ушинского стали предметом полемики, начиная с момента их появления в печати и по настоящее время. Идеи природоохранительного воспитания были реализованы и в других учебных книга, авторами которых являлись Н.Ф. Бунаков, Д.И.Тихомиров, С.И. Миропольский и др.

Решая задачу выявления педагогических условий природоохранительного воспитания учащихся, мы установили, что в качестве средства воспитания признавалось изучение природы родного края. Её изучение позволяло формировать национальный характер, религиозно-нравственные воззрения на окружающий мир, ответственность человека перед потомками за сохранение ее, так как она является главной летописью для будущих поколений. Эта идея должна быть принята учительской общественностью и реализована в практике работы современной школы.

Осуществленное нами исследование направлено на то, чтобы содействовать вооружению учителя научным методом исторического подхода к современным явлениям вопроса. На основе изучения исторического опыта природоохранительного воспитания учащихся в русской народной школе можно совершенствовать формы, методы экологического воспитания в современной школе. Такое совершенствование может осуществляться как по линии гармонического развития всех прогрессивных тенденций, сложившихся на основании исторического опыта, так и по линии учета достигнутых в рассматриваемый период результатов природоохранительного воспитания при связи обучения на уроках с разнообразной внеклассной работой.

В ходе работы мы попытались показать, что теоретические выводы, идеи, выдвинутые русскими педагогами по природоохранительному воспитанию, с одной стороны, являлись обобщением педагогической практики, а, с другой стороны, содержали в себе установки на будущее, т.е. указывали дальнейшие перспективы. Стимулировали движение природоохранительной деятельности в плане сочетания ретроспективы и перспективы.

Основными условиями природоохранительного воспитания явились:

Природоохранительное воспитание учащихся в русской школе обеспечивалось соблюдением следующих педагогических условий: а) взаимосвязанностью компонентов содержания образования: научного, народного, православного, практического; б) следование педагогическим принципам: научность, доступность, наглядность, активность учащихся, связи обучения с жизнью, гуманизации, целостности процесса воспитания и обучения, учет возрастных особенностей, антропологический принцип, активность учащихся и др.; в) ориентация содержания учебных предметов на знакомство учащихся с природой и формирования убеждений в необходимости бережного отношения к ней. г) использование форм, методов и средств обучения и воспитания, позволяющих, знакомить учащихся с окружающим миром, формировать ценностное отношение к природе, людям и себе, воспитывать ответственность за сохранение окружающего мира и не разрушать его в деятельности.

Значение идей природоохранительного воспитания, предложенных педагогами в XIX веке, для современного экологического образования школьников заключается в целостном и многомерном изучении мира природы, с позиций научности, народности, органического единства законов «естественного и нравственного», ответственности человека за сохранение окружающей среды, воздействия природы на духовный мир человека. Особую актуальность для нашего времени имеет то обстоятельство, что природоохранительное воспитание в XIX в. рассматривалось в неразрывной связи с духовно-нравственным воспитанием.

Развитие грамотной речи учащихся рассматривалось учеными в контексте природоохранительного воспитания. Речь имеет значение не только как средство развития логического мышления, но и как органическое свойство человека как части природы.

В православном вероучении речь рассматривается как дар Божий, отличающая человека от животного мира. Заслуга педагогов XIX в., в частности школы К.Д. Ушинского в С.А. Рачинского, заключается в синтезе позитивных научных знаний о языке с вероучением православной церкви.

Выявленная нами общая картина развития природоохранительного воспитании в России во второй половине XIX в. позволяет сделать вывод о том, что к этому времени сложились благоприятные условия для создания и развития русской народной школы на всех уровнях начального, среднего и высшего образования. Это обеспечивалось целенаправленной государственной политикой, усилиями общественных и частных лиц в соответствии с задачами русской народной школы и традициями широких народных масс.

В связи с тем, что в работе было рассмотрено природоохранительное воспитание учащихся в начальном звене русской школы, то дальнейшая перспектива исследования будет заключаться в исследовании природоохранительного воспитания в других звеньях русской школы.

Список литературы диссертации автор научной работы: кандидата педагогических наук, Ватутин, Алексей Васильевич, Липецк

1. Архив Воронежского областного краеведческого музея /ВОКМУ Фонд Бунакова. Заметки о результатах обучения в наших народных школах. Оттиск / Бунаков, Н.Ф. - ВОМ. 5122а-34. - С. 17.

2. Архив областного краеведческого музея г. Калуги. Фонд народного образования области.

3. Архив краеведческого музея г. Данкова Липецкой области. Фонд народного образования.

4. Архив краеведческого музея г. Усмани Липецкой области. Фонд народного образования.

5. Азбука для крестьянских детей / Ф. Студицкий. СПб., 1860.

6. Азбука для обучения (чтение и письма) / Н.Островской. Москва, 1878.

7. Азбука. Уроки чтения, письма с постепенно возрастающим числом букв / Н.Ф. Бунаков СПб., 1881.

8. Алешина, И.В. Реализация принципа экологического образования учащихся 5-6 классов в школьном курсе биологии. Автореферат на соискание ученой степени к.п.н. / И.В. Алешина. - СПб.: 2001.

9. Антипина, Т. Экология и образование. / Т. Антипина // Воспитание школьников. 2000. - №6. - С. 15.

10. Антология педагогической мысли России второй половины XIX начала XX века / под ред. П.А. Лебедева. - М.: Педагогика, 1990. -603 с.

11. Арапов, А.И. Проблема дифференцированного обучения в истории отечественной педагогике и школы конца XIX начала XX века. Автореферат на соискание ученой степени к.п.н. / А.И. Арапов. Новосибирск, 2000.

12. Атангулов, У.Ш. Постулаты назидание народной педагогики /У.Ш. Атангулов // Педагогика. - 2001. - № 7. - С. 40-42.

13. Багоцкий, С.В. О школьном природоохранном образовании / С.В.Багоцкий // Экология и жизнь. 2002. - № 4.

14. Баркова, Н.Н. Нравственный идеал в русской педагогике ( конец 19 начало 20 века ) : История школы и педагогики. / Н.Н. Баркова // Педагогика. 1998. - № 2. - С. 70 - 75.

15. Барсукова, Т.И. Российская мысль о государственной пользе в сфере воспитания / Т.И. Барсукова // Педагогика. 2000. - №7. - С.67-72.

16. Бахтиярова, В.Ф. Педагогические условия экологического воспитания учащихся в летних оздоровительных лагерях: Автореферат дисс. на соискание ученой степени. к.п.н.(13.00.01) / В.Ф. Бахтиярова Уфа, 2000.

17. Белинский, В.Г. Избранные педагогические сочинения / под ред. А.Ф. Смирнова. М., 1982. - С. 14.

18. Беленчук, Л.И. Концепция национального воспитания на рубеже XIX XX века / Л.И. Беленчук // Педагогика. - 1999. - №5. - С.89-93

19. Белов, П.Т. Философия выдающихся русских естествоиспытателей. / П.Т. Белов. М.: Изд-во "Мысль", 1970.

20. Белозерцев Е.П. Образ и смысл русской школы:Очерки пркладной философии / Е.П. Белозерцев. -Волгоград: Перемена, 2000. -461. с.

21. Белофост, М.Г. Церковно-приходские школы в Тамбовской губернии во второй половине XIX - начала XX вв. / М.Г. Белофост. // Вестник Тамбовского ун-та. - Тамбов, 1998. - Выпуск 1. - С. 45-47.

22. Белых, Н.М. Особенности обучения и воспитания в церковноприходской школе России второй половины XIX века. Диссертация на соискание ученой степени к.п.н. / Н.М. Белых М., 1998. - 157 с.

23. Березовская, Л.Г. История русской культуры: учебное пособие в 2-х частях / Л.Г. Березовская, Н.П. Берлякова М.: ВЛАДОС. - 2002. -Ч. 2.- 400 с.

24. Бернштейн, М.С. По педагогической Америке. / М.С.Бернштейн. Москва: Работник просвещения, 1930.

25. Беседы о здоровье и болезнях / Я. Капустин // Русский начальный учитель. СПб. - 1880.

26. Беседы о русском лесе. / Д. Кайгородов. СПб.: 1880. - 185 с.

27. Бим-Бад, Б.М. Антропологические основания теории и практики образовании. / Б.М. Бим-Бад // Педагогика. -1994. № 5. - С. 3-11.

28. Благова, Т.И. Родоначальники славянофильства. А.С. Хомяков и И.В. Киреевский / Т.И. Благова. -М.: Высшая школа, 1995. 352 с.

29. Боброва, О.В. Взаимодействие светского и религиозного образования в России: Современная практика / О.В. Боброва // Образование и наука. 2001. - № 2. - С. 144 - 156.

30. Бобылева, Л.О. О воспитании экологической культуры / Л.О. Бобылева // Высшее образование в России. 2003. - №5. - С. 132-135.

31. Богданов, А.П. Животные беспозвоночные./ А.П. Богданов. -СПб., 1864.

32. Богуславский, М.В Генезис гуманистической парадигмы образования в отечественной педагогике начала XX века / М.В. Богуславский // Педагогика. 2000. - №4. - С. 63-70.

33. Богуславский, М.В Национальные и общечеловеческие ценности в российском образовании первой четверти XX века / М.В. Богуславский // Магистр. 1998. - №2. - С. 39-52.

34. Богуславский, М.В. Ценностные ориентации Российского образования в первой трети XX в. / М.В. Богуславский // Педагогика. 1996. - № 3. - С. 72-75.

35. Бойко, Н.Я. Природоохранительное просвещение в школе (охрана природы Кузбасса); учебное пособие для студентов ЕГФ и учителей биологии / Н.Я.Бойко, Т.Н.Гагина. Новосибирск, Новосибирский Пед. Институт, 1989.

36. Бондаревская, Е.В. Смысл и стратегии личностно-ориентированного воспитания / Е.В. Бондаревская // Педагогика. 2001. -№1. - С. 17-24.

37. Борисова, Е. Мудрость народной педагогики: традиции воспитания детей в русской крестьянской семье / Е.Борисова // Народное образование. -1998. № 9-10. - С. 74-76.

38. Бугаевич, И.В. Ручной труд в общеобразовательных средних школах дореволюционной России / И.В. Бугаевич Д.: ЛГПИ имени Герцена, 1959.-23 с.

39. Бунаков, Н.Ф. Избранные педагогические сочинения / Н.Ф. Бунаков М.: Издательство Академии педагогических наук РСФСР, 1953. -412 с.

40. Бунаков, Н.Ф. Школьное дело / Н.Ф. Бунаков. СПб.: Гутзац, 1906.-230 с.

41. Валеев, Г. Объект, предмет и тема научного исследования (в педагогике) / Г. Валеев // Педагогика. 2002. - №2. - С. 27-31.

42. Валеева, Р.А. Воспитание в педагогических системах XIX XX вв. // Общая стратегия воспитания в образовательной системе России / под ред. профессора И.А. Зимней. - М.: Исследовательский центр проблем качества подготовки специалистов, 2001.- С. 129-142.

43. Васильцова, З.П. Мудрые заповеди народной педагогики. 2-е издание дополн. / З.П. Васильцова. Москва: Педагогика, 1988.

44. Вахтеров, В.П. Избранные педагогические сочинения /сост. JI.H. Литвин, Н.Т. Бритаева. М.: Педагогика, 1987. - 400 с.

45. Вахрушев, А.А. Мир и человек: методические рекомендации к учебнику 1 класса / А.А.Вахрушев. -М.: Просвещение, 1996.

46. Вессель, Н.Х. Педагогические сочинения / Н.Х. Вессель. М., 1959.-319 с.

47. Вентцель, К.Н. Основные задачи нравственного воспитания / К.Н. Вентцель // Вестник воспитания. 1896. - №2. - С. 1-47.

48. Видякова, З.В. К.Д.Ушинский о народном воспитании // Педагогические традиции воспитания и обучения подрастающего поколения / З.В. Видякова. Липецк, 1996. - С. 10-14.

49. Видякова, З.В. Педагогика и антропология в учении святителя Тихона Задонского / З.В. Видякова. Москва, 2004. - 33 с.

50. Владиславлев, В. Уроки по классу христианской педагогики / В. Владиславлев. М., 1875. - 279 с.

51. Власова, И.М. Народные традиции как условие приобщения учащихся к современной культуре / И.М.Власова // Наука и образование. -2002. №2. - С. 72-77.

52. Водовозов, В.И. Русская народная педагогика. Избранные педагогические сочинения / Составитель B.C. Аранский. М.: Педагогика, 1986. - С. 379-405.

53. Воздух нас окружающий // Досуг и дело. СПб., 1879. - 40 с.

54. Волков, Г.Н. Трудовое воспитание в народной педагогике / Г.Н. Волков // Школа и производство. 2000. - №3. - С. 26-31.

55. Волкова, А. Идеализм / А.Волкова // Вестник воспитания. -1892.-№7.- С. 1-4.

56. Вопросы экологии и охраны природы / под ред. В.Ф. Барабано-ва. Л.: Издательство ЛГУ, 1981. - 120 с.

57. Воспитание умственное, нравственное и физическое / Г. Спенсер. СПб., 1877.

58. Вшиленкова, Е.А. Заботясь о душах подданных. Православная школа в России в первой четверти XIX века. / Е.А. Вшиленкова. // Педагогика. 2002. - №2. - С. 49-52.

59. Ганелин, Ш.И. Очерки истории школы и педагогической мысли народов СССР: вторая половина XIX века / Ш.И. Ганелин, Л.Д. Глубо-ковский, П.В. Горностаев. М.: Педагогика, 1976. - 600 с.

60. Гагарин, А.В. Воспитание природой / А.В. Гагарин // Биология в школе. 2000. - №3. - С. 16-20.

61. Гилязов, Д. Традиции народной педагогики в действии / Д. Гилязов // Воспитание школьников. 2000. - № 6. - С. 8-16.

62. Грамматин, В. О роли духовенства в воспитании народа. / В. Грамматин Москва. - 2001. - №11. - С. 229- 234.

63. Григоров, П.А. Идея развития в программах и учебниках по зоологии в дореволюционной и советской школе / П.А. Григоров. Воронеж., 1955. - 20 с.

64. Григорьев, В.В. Исторический очерк русской школы / В.В. Григорьев. М.: Товарищество типографий А.И. Мамонтова, 1900. - 435 с.

65. Грум-Гржимало К.И. Руководство к воспитанию, образованию и сохранению здравия детей / К.И. Грум-Гржимало. 1843.

66. Данилюк, Н.Я. Развитие педагогической антропологии в контексте русской культурной традиции / Н.Я.Данилюк // Педагогика. 2003.- №1. С. 82-88.

67. Дежникова, Н.С. Экологическое воспитание в контексте социокультурной динамики / Н.С. Дежникова // Педагогика. 2002. - №10. -С. 51.

68. Дмитриева, Н.Я. Учебная хрестоматия для 2 класса трехлетней начальной школы / Н.Я.Дмитриева. М.: Просвещение, 1998. - 3-е издание.- 240 с.

69. Дмитриева, Т.А. Передовой педагогический опыт природоохранной работы в школах страны / Т.А. Дмитриева, В.К. Луканкина и др. // Проблемы экологического образования в педвузе и школе: Межвузовский сборник научных трудов. -М.: МПУ, 1992. С. 43-49.

70. Егоров, С.Ф. Классическая русская педагогика: история и современность / С.Ф. Егоров // Педагогика. 2002. - №4. - С. 63-69.

71. Егоров, С.Ф. Методологические идеи К.Д. Ушинского в процессе обретения педагогического статуса науки /С.Ф. Егоров // Педагогика. -1999. №6. - С.75-83.

72. Ерёмкин, А. И. Земская школа: возникновение и развитие /А.И. Ерёмкин. // Земская школа и педагогика. Белгород, 1997. - С. 2437.

73. Ерошкин, Н.П. История государственных учреждений дореволюционной России. М.: Высшая школа, 1983. - 325 с.

74. Журнал Комитета. М., 1855. - С. 7.

75. Закон Российской Федерации "Об образовании" (с последующими дополнениями и изменениями) от 10 июля 1992 года № 3266-1

76. Закон Российской Федерации "Об охране окружающей среды" от 10 января 2002 года № 7-ФЗ.

77. Захлебный, А.Н. Охрана природы в школьном курсе биологии: пособие для учителя / А.Н. Захлебный, И.Д. Зверев, И.Т. Суравегина. -М.: Просвещение, 1977. 207 с.

78. Захлебный, А.Н. Экологическое образование школьников во внеклассной работе: пособие для учителя / А.Н Захлебный, И.Т. Суравегина. -М.: Просвещение, 1984. 160 с.

79. Земская школа и педагогика (материалы научного семинара «Земская школа и педагогика») Белгород, 1997. - 200 с.

80. Зуев, В.Ф. Педагогические труды / В.Ф. Зуев. М., 1956. - С.320.

81. Зятева, JI.A. Философско-педагогические воззрения отечественных ученых на проблему экологического воспитания / JI.A. Зятева // Педагогика. 2002.- №7. - С. 32-35.

82. Измайлова, А.Б. Особенности русской народной педагогики /Измайлова А.Б. // Национальные лики педагогических универсалий: проблемы теории и истории русской педагогики. Владимир, 2005. - С. 306316.

83. Ильин, Г.Л. Проблемы от века к веку: функциональная неграмотность / Г.Л. Ильин // Университетская книга. 2000. - №2. - С. 18-35.

84. Ильминский, Н.И. Беседы о народной школе / Н.И. Ильмин-ский // Избранные места из педагогических сочинений. Казань, 1892. - С. 50.

85. Исторический очерк Красносельского фабричного двухклассного МНП имени Её императорского Величества государыни императрицы Марии Федоровны / сост. Н.В. Розов и др. СПб.: 1912. -120 с.

86. История педагогики и педагогической антропологии / под ред. Г.Б. Корнетова. -М.: УРАО, 2001. 157 с.

87. История естествознания как учебной дисциплины в средней общеобразовательной школе России 19 века. М., 1945. - 181 с.

88. К.Д.Ушинский и современная школа (тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции). Курск, 1994. - 280 с.

89. Как обучать грамоте ребят и взрослых / Н.А. Корф. СПб.,1880.

90. Как помогать во внезапных несчастных случаях, угрожающих жизни. -СПб.: Издательство редакции Мирской вестник, 1880.

91. Как узнать почву и какие бывают почвы / Н. Горбунова. СПб.,1880.

92. Каптерев, П.Ф. Избранные педагогические сочинения / под ред. A.M. Арсеньева. М., 1982. - С. 272- 350.

93. Каптерев, П.Ф. О саморазвитии и воспитании / П.Ф. Каптерев // Педагогика. 1999. - №7. - С. 73-84.

94. Кильянова, JI.B. Земские школы в Нижегородской губернии / Л.В.Кильянова // Педагогика. 2000. - № 9. - С.78-82.

95. Кондаков, А.И. Директор народных училищ И.Н. Ульянов / А.И. Кондаков. М., 1964. - С. 320.

96. Концепция экологической безопасности России

97. Корнилов, А.А. Курс истории России 19 века / А.А. Корнилов. -М., 1993.-203 с.

98. Коростелева, Т.В. Развитие экологической деятельности учащихся при обучении биологии / Т.В. Коростелева СПб.: Изд. РГПУ им. Герцена, 1999. - 135 с.

99. Корнетов, Г.Б. Педагогические парадигмы базовых моделей образования: Учебное пособие / Г.Б. Корнетов. -М.: УРАО, 2001. 124 с.

100. Кудинова, М.И. Формирование начального образования в России конца XIX- начала XX в. / М.И. Кудинова. Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук. Оренбург, 2000 .- 180 с.

101. Кудрявая, Н.В. Лев Николаевич Толстой о смысле жизни: образ духовного и нравственного человека в педагогике Л.Н.Толстого / Н.В.Кудрявая. М.: Красный пролетарий, 1993.

102. Кудрявцева, Е.М. Экологическое воспитание школьников / Е.М. Кудрявцева. М., 1983.

103. Куликов, В.Б. Педагогическая антропология: истоки направления, проблемы Свердловск /В.Б. Куликов - Изд-во Уральского Университета, 1988.

104. Кумарин, В. Школу спасет педагогика, но природосообразная / В. Кумарин // Народное образование. 1997. - №5. - С. 10-20.

105. Кушнир, А. Природосообразность и народная педагогика / А. Кушнир // Народное образование. 1999. - №1-2. - С. 86-90.

106. Латышина, Д.И. История педагогики: Воспитание и образование в России (конец XIX- начало XX века) / Д.И. Латышина. М.: Издательский Дом «Форум», 1998. - 582 с.

107. Лордкипанидзе, Д.О. Педагогическое учение К.Д.Ушинского / Д.О. Лордкипанидзе. -М.: Учпедгиз, 1950. 368 с.

108. Лесгафт, П.Ф. О преподавании анатомии и естественных наук вообще. Сб. "Памяти П.Ф. Лесгафта" / П.Ф. Лесгафт М., 1924.

109. Лесгафт, П.Ф. Отношение анатомии и естественных наук вообще. / П.Ф. Лесгафт. СПб., 1903. - Т.6. - Вып. 4.

110. Лесгафт, П.Ф. О физическом образовании в школе. Избранные педагогические сочинения / сост. И.Н. Решетень. -М., 1988. С. 312-335.

111. Липецкая школа /Сост. Шахов В.В. -М., 1995. С.717-720.

112. Литвин, Л.Н. Журнал «Русская школа» (1890-1917 гг.) о народном образовании, обучении и воспитании / Л.Н.Литвин. Диссетация на соискание ученой степени к.п.н. М., 1975. - 261с.

113. Лучанский, С.Н. Влияние русской естественно научной мысли на развитие передовых педагогических идей в 30-50 е гг. XIX в. / С.Н. Лучанский. - М., 1967. - 25 с.

114. Макарцева, И.Н. Духовные ценности русской педагогической культуры / И.Н. Макарцева // Педагогика. 1998. - №1. - С.81-86.

115. Мамедов, Н.М. Экология, учебное пособие для 9-11 класса общеобразовательной школы / Н.М. Мамедов, И.Т. Суравегина. М.: Школа Пресс, 1996.-46 с.

116. Мартынов, И.И. Три ботаники / И.И. Мартынов. СПб., 1867.

117. Медынский, Е.Н. История русской педагогики с древнейших времен до Великой Октябрьской социалистической революции / Е.Н.Медынский. -М., 1938. 2-ое изд. испр. и доп. - 235 с.

118. Менделеев, Д.И. Сочинения в 25 томах / Д.И. Менделеев. М.-Л., 1952.-т. 23.-276 с.

119. Меньшиков, В.М. К.Д. Ушинский и русская школа / В.М. Меньшиков // Педагогическое наследие К.Д. Ушинского и проблемы современного образования. Тезисы докладов и выступлений Всероссийской научно-практической конференции. Курск, 1999. - С. 49-70.

120. Моисеев, Н.Н. Экологическое образование: педагогическая концепция и развитие в современной России / Н.Н. Моисеев // Биология в школе. 1996. - № 3. - С.29-32.

121. Минюкова, С.В. Вопросы воспитания в отечественной педагогике второй половины XIX начала XX века // Педагогика. - 1999. - № 7. - С. 93-98.

122. Миропольский, С.И. О методах обучения / С.И. Миропольский // Народная школа. 1877. - № 10. - С. 62-68.

123. Нейваненко С.Г. Четырехлетняя народная школа с дополнительными курсами. М.: Типография товарищества И.Д.Сытина, 1912. -96 с.

124. Научный архив АПН РФ, ф.17, опю1, ед.хр.97.

125. Наша учебная литература // Журнал Министерства народного просвещения. 1867. - №10. - С. 42-43.

126. Новикова, Л.И. Воспитание как педагогическая категория / Л.И. Новикова // Педагогика. 2000. - №6. - С. 28-35.

127. О наших перелетных птицах / сост. Д. Кайгородов. СПб.,1882.

128. Описание человеческого тела с гигиеническими указанием иобщий обзор животных и растений / сост. К.Ф. Ярошевский. М., 1880.

129. Основные направления и тенденции развития педагогической науки конца XIX начала XX века: сборник научных трудов / под ред. К.И. Салимовой. - М.: НИИОП, 1980. - 164 с.

130. Острогорский, А.Н. Избранные педагогические сочинения / А.Н. Острогорский. М.: Педагогика, 1985. - С. 119- 272. 132 а. Отчет и исследования по кустарной промышленности в России. Изд. Министерства государственного имущества, т. П-СПБ, 1894. С.82.

131. Очерки истории школы и педагогической мысли народов СССР: вторая половина XIX века /Ш.И. Ганелин, Л.Д. Глубоковский, П.В. Горностаев и др. М.: Педагогика, 1976. - 600 с.

132. Очерки истории школы и педагогической мысли народов СССР: конец XIX начало XX века / под ред. Э.Д. Днепрова. - М.: Педагогика , 1991. - 445 с. конец XIX- начало XX века / Под ред. Э.Д. Днепрова . - М.: Педагогика, 1991. - 445 с.

133. Пирогов, Н. И. Избранные педагогические сочинения / сост. А.Н. Алексюк, Г.Г. Савенок. -М., 1985. 144 с.

134. Писарев, Д. Избранные педагогические сочинения / Д. Писарев. М.: Педагогика, 1985. - 350 с.

135. Плешаков, А.А. Мир вокруг нас / А.А. Плешаков, М., 2003. 137 а. Победоносцев К.П.Ученье и учитель. СПБ.: 1905.-120 с.

136. Православие самодержавие - народность: образование в Николаевской России // Высшее образование сегодня. - 2003. - № 3. - С. 5459.

137. Природоохранительное просвещение на уроках биологии. Методические рекомендации. М.: МГПИ, 1986.

138. Протасов, В.Ф. Экология, здоровье и охрана окружающей среды в России: учебное и справочное пособие / В.Ф. Протасов. М.: Финансы и статистика, 2000. - 670 с.

139. Прохоров, Б.Б. Экология человека. Понятийно-терминологический словарь / Б.Б.Прохоров М.: Изд-во МНЭПУ, 1999. -345 с.

140. Пыльнев, Ю.В. История школы и народного просвещения Воронежского края. XVIII начало XX века / Ю.В. Пыльнев, С.А. Рогачев. -Воронеж: Центр духовного возрождения Черноземного края, 1999. - 528 с.

141. Разин, А.Е. Мир Божий / А.Е. Разин. СПб., 1860.

142. Рачинский, С.А. О воспитании: для педагогов, родителей, студентов пед. вузов. / С.А. Рачинский. М.: Школьная пресса, 2004. - 189 с.

143. Рачинский, С.А. Сельская школа: Сборник статей. / С.А. Рачинский. -М.: Педагогика, 1991,173 с.

144. Рождественский С.В. Исторический обзор деятельности Министерства народного просвещения. 1802-1902. СПб., 1902. - 785 с.

145. Розанов, В.В. Сумерки просвещения / сост. В.Н. Щербаков. -М., 1990.-620 с.

146. Романов, А.П. Начальное образование русских крестьян в последней четверти XIX начале XX века, официальная политика и общественная модель. / А.П. Романов. Автореферат на соискание ученой степени к. истор. наук. - Челябинск, 2003.

147. Русская подвижная школа / Н.Ф. Бунаков. -СПб., 1881. С.78.

148. Сергеева, С.В. Домашнее образование в России в первой половине XIX века / С.В. Сергеева // Педагогика.- 2003. №7. - С. 93.

149. Сиземская, И.Н. , Новикова Л.И. К.П. Победоносцев: школа и общество// Педагогика. 1999, - № 3. - С 80-85.

150. Слобожанин, М. Из истории и опыта земских учреждений в России / М.Слобожанин. СПб., 1913. - 448 с.

151. Смирнов, В.З. Реформы начальной и средней школы в 60-х годах XIX в / В.З. Смирнов. М.: АПН РСФСР, 1954. - 311с.

152. Список учебных заведений Министерства народного просвещения по городам и селениям. СПб., 1908. - 78 с.

153. Стоюнин В.Я. Избранные педагогические сочинения/ В.Я. Стоюнин. М.: Педагогика, 1991.-368.

154. Субетто, А.И. Противоречия экономического развития России и стратегия выхода из исторического тупика / А.И. Субетто. СПб., 2000. -С. 32.

155. Тихомиров, Д.И. Автобиография / Д.И. Тихомиров // Педагогический сборник. -1901. №4. - С. 45-47. Толстой JI.H.

156. Ушинский, К.Д. Собр. соч. в 11 т. / К.Д. Ушинский. M.-JI., 1948.-Т. 1.-С. 51-252; 260-308.

157. Ушинский К.Д. Собр. соч. в 11 т. / К.Д. Ушинский. M.-JL, 1948.-Т. 2.-С. 256-305.

158. Ушинский, К.Д. Собр. соч. в 11 т. / К.Д. Ушинский. M.-JI. - Т. 4. - С.87-254; 277-282; 607-626.

159. Ушинский, К.Д. Собр. соч. в 11 т. / К.Д. Ушинский. M.-JI.,1948. Т. 5. - С.446- 545.

160. Ушинский, К.Д. Собр. соч. в 11 т. / К.Д. Ушинский. M.-JL,1949.-Т. 6.-С. 423-512.

161. Ушинский, К.Д. Собр. соч. в И т. / К.Д. Ушинский. M.-JL,1950.-Т. 8.-С. 150-270.

162. Фальборк, Г. Настольная книга по народному образованию в 2-х томах / Г. Фальборк, В. Чарнолуский.- СПб.: Типография Б. М. Вольфа, 1899.- Т. 1.-713 с.

163. Федеральный базовый компонент экологического образования // Биология в школе. 1993. - № 4. - С. 41.

164. Федоров, В.А. Крестьянские школы грамотности в России в 19 веке / В.А. Федоров // Педагогика. 2000с. - № 10. - С. 80-86.

165. Флоренский Павел. Оправдание Космоса /Павел Флоренский. -СПб.: РХГИ, 1994. С.27-60.

166. Фомичёв, И.В. Развитие общеобразовательной школы России до 1917 г. / И.В. Фомичев. Воронеж: ВОИПКРО, 1996. - 156 с.

167. Фурсов, С. В. Крестьянские школы грамотности в России XIX века / С.В. Фурсов // Педагогика. 2000. - №10. - С. 80-86.

168. Фурсова, С.В. История народной школы Тамбовской губернии в постреформенный период (1861- 1904гг.) / С.В. Фурсова. Тамбов: ТГТУ, 2000. - 200 с.

169. Харламов, И.Ф. Формирование личностных качеств в процессе воспитания / И.Ф. Харламов // Педагогика. 2003. - №3. - С.52-60.

170. Цитович, С.Г. Земледельческая школа в Горы-Горках Моги-левской губернии в XIX веке. Из истории с/х образования в России и Белоруссии / С.Г. Цитович. Минск, 1947. - 130 с.

171. Чернышевский, Н.Г. Избранные педагогические сочинения / сост. А.В. Плеханов; под ред. А.Ф. Смирнова. М., 1983. - С. 43- 79.

172. Чехов, Н.В. Народное образование в России с 60-х годов XIX века / Н.В. Чехов. М.: Польза, 1912.-224 с.

173. Шаргина, М. Начало начал: о физическом воспитании в дореволюционной России / М. Шаргина // Спорт в школе. 1996. - №10. - С.З.

174. Шахвердов, Г.Г. П.Ф. Лесгафт о роли "слова " и "показа" в процессе обучения физическим упражнениям / Г.Г. Шахвердов. М.: Известия АПН РСФСР, 1949. - Вып. 23.

175. Шварц, С.С. Методологические аспекты исследования биосферы / С.С. Шварц. М., 1975. - С. 110.

176. Школа и педагогическая мысль России периода 2-х буржуазно-демократических революций: Сборник научных трудов / под ред. Э.Д. Днепрова М.: АПН СССР, 1984. - 245 с.

177. Школьная диэтика (сбережение здоровья детей посещающих школу) / Вл. Фармаковский. Симбирск, 1879. - 188 с.

178. Щульга, И.К. История школьного естествознания в России / И.К. Щульга. Киев, 1954. - 19 с.

179. Юркевич, П.Д. Чтения о воспитании / П.Д. Юркевич. М., 1865.-С.31.

180. Ястребцов, И.М. О системе наук, приличных в наше время детям / ИМ. Ястребцов. СПб., 1833.